【導讀】本人聲明茲呈交的學位論文是本人在導師指導下完成的研究成果。集體的科研成果，均在論文中以明確的方式說明。本人依法享有和承擔。由此論文所產(chǎn)生的權利和責任。和磁盤，允許學位論文被查閱和借閱。類彈性蛋白多肽，是一種非常重要的具有彈性。性，使其在蛋白純化、作為藥物載體、組織工程等方面得到廣泛的應用。值探討與其序列組成、每一單體的Xaa數(shù)量、濃度等因素間的關系具有重要意義。列出發(fā)，利用最小中位方差回歸，找出其序列相關系數(shù)的最佳階數(shù)。經(jīng)網(wǎng)絡獲得的預測模型最佳，其絕對誤差為℃，均方根誤差為℃.白相變溫度的影響。結(jié)果表明：mM的Na2CO3能使25µMELP[KV8F-20]相變溫。譜分離純化奠定基礎。高，類彈性蛋白經(jīng)歷可逆相變，由舒展的構象過渡到折疊構象。溶液條件下，ELP[KV8F-20]在350K時發(fā)生相變，375K時ELPs已經(jīng)變性。析，推斷疏水作用與結(jié)合水的減少在ELP[KV8F-20]的相變過程中起到關鍵作用?？偨Y(jié)了相關結(jié)論，這可為今后利用ELPs純化重組蛋白提供經(jīng)驗積累和

　　

【正文】 求一種簡單、高效的蛋白純化化方法具有特別重要的意義。利用 ELPs 融合蛋白也具有可逆相變的特性，使用采用 ITC（ inverse transition cycling）純化 ELPs 的重組蛋白具有簡單、快速等優(yōu)點。有理由相信這種純化蛋白方式比較容易從實驗室規(guī)模放大到工業(yè)規(guī)模。另外， ELPs 的相變機理目前處于爭論之中，本課題從分子模擬方法探討 ELPs 的相變機理，以最微觀的方式解析其機理具有重要意義。 課題的研究得到導師張光亞副教授的國家自然科學基金資助項目（ 20806031）和福建省自然科學基金（ 2020J01030）資助項目 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 10 第二章 使用偽氨基酸組成和 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡預測類彈性蛋白多肽的相變溫度 引言 tT 可作為定量描述 ELPs 相變溫度性質(zhì)一種最便利的參數(shù)。在這之前， Urry 等認為， tT 是關于 ELPs 序列、多肽鏈長度、 Xaa 種類及 mole fraction 的函數(shù) [47]， 然而， Chilkoti 等 [16]認為 Urry 等合成的 ELPs 大多是依賴于化學法，因而 ELPs 的長度就不能得到精確控制，故不能很好地描述 ELPs 序列，鏈長及濃度與 tT 的內(nèi)在關系。Chilkot 等 [16]利用重組基因進行克隆表達，得到了在序列和多肽鏈長均能精確控制的ELPs。他們用非線性回歸分析描述了 ELPs 序列鏈長及濃度與其 tT 關系。但是，Chilkoti 等用擬合方法得到的模型僅能預測三種 ELPs 文庫的 tT ，因而應用范圍受到限制。 實驗材料 數(shù)據(jù)來源與預測工具 試驗數(shù)據(jù)來源 文中所用的數(shù)據(jù)取自于 Olson S D 的博士論文 [48]，文獻數(shù)據(jù)表格中所涉及到的參變量有 ELPs 的分子量 (MW)、 ELP 每一單體的 Xaa 數(shù)量 (Kperiod)、 ELPs 的濃度([ELP])。 偽氨基酸組成 偽氨基酸組成包含 ??20 個變量，最早由 Chou 等 提出，其原理參見文獻 [49]，目前已得到廣泛應用。由于文中所涉及的 ELPs 氨基酸組成極為相似，而且種類很少，為了減少輸入變量數(shù)目，本文對其略作調(diào)整，僅取其后的 ? 個變量，即氨基酸相關華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 11 系數(shù)， ELPs 相關系數(shù)的階數(shù) ? 從 1 取到 10。氨基酸相關系數(shù)計算的網(wǎng)址為： [50]. 支持向量機 支持向量機 (SVM)是 Vapnik[51]于 1995 年提出的機器學習算法，它具有運算速度快、分類準確等特點，尤其在樣本量較少時更具優(yōu)勢。 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡是由大量的神經(jīng)元廣泛互連而成的網(wǎng)絡，是模擬人在思維時神經(jīng)元的工作原理而形成的一個非線性的動力系統(tǒng)， BP 網(wǎng)絡的學習采用梯度下降算法，使得網(wǎng)絡的實際輸出與期望輸出的均方差極小化，且具有自適應機制，通過訓練和學習，達到對知識進行分類、模式判別、聯(lián)想記憶等能力 [52]。 均勻設計 由于 SVM 和 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡在運行時都有參數(shù)需要選擇，以達到最佳效果。本文采用均勻設計來選擇適當?shù)倪\行參數(shù)。均勻設計由我國數(shù)學家方開泰教授所創(chuàng)造 [53，它是將數(shù)論和多元統(tǒng)計相結(jié)合的一種新穎的試驗方法。 為了定量比較擬合和測試效果，特定義以下三個特征指標 : (1)平均絕對百分比誤差：1||1 ||n t tt tyyM P A E ny???? ? （ 2）均方根誤差： 211 ()n tiM S E y yn????? （ 3）平均絕對誤差：11 ||n tttM A E y yn????? 式中， ty 和 ty? 分別表示實際值和擬合值 (或預測值 ) 。 模型預測的結(jié)果采用目前常用的“留一法”，即對 n 組數(shù)據(jù)，每次取 1 個作測試，其它 n1 個作為訓練樣本，共進行 n 次循環(huán)，使得樣本中所有數(shù)據(jù)都能進行預測 。 文中實現(xiàn)所有的算法的軟件來自于 WEKA()，該程序包基于 JAVA 虛擬機開發(fā)。文中使用的算法 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡，支持向量機及最小中位方差回歸。使用的 PC為 DELL precisionTM490。 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 12 結(jié)果與分析 氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)的選擇 根據(jù)文獻 [49]，氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)（ ? ）是偽氨基酸組成一重要參數(shù)，選擇一個較好的 ? 做為交叉驗證的運行參數(shù)，文獻的數(shù)據(jù)中相變溫度呈離散分布，使用最小中位方差回歸可能更為精確 [5455]，且它在運行過程中無需調(diào)整參數(shù)，故選取該法來檢測 ? 取值 . 參數(shù) ? 經(jīng)最小中位方差回歸檢測獲得的 RMAE、 MPAE 及 MAE 關系如表 所示。由表 可知，當 ? =8 時， MAE 為 ， RMSE 為 ， MPAE 為 ，即擬合所得 ELP 相變溫度準確率最高，因此取 ? =8。 表 ：氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)（ ? ）對 MAE、 MSE 和 MPAE 的影響 Table : Effect of the order of correlation coefficient for amino acids （ ? ） on MAE、 MSE and MPAE Lamda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MAE MSE MPAE 當 ? =8 時，執(zhí)行最小中位方差回歸得到 ELPs 的相變溫度擬合模型如下： 2 1 3 4 5 6 7 8 9 1 00 .4 9 2 .0 2 0 .4 6 2 .3 1 1 .3 0 2 .0 4 0 .4 8 0 .3 1 0 .1 8 1 .0 7 8 0 .4 9y x x x x x x x x x x? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?1x～ 8x 分別為偽氨基酸組中相關系數(shù)，從方程可見，第一、第 四和第六個相關系數(shù)對相變溫度有較大的負面影響，而第五個相關系數(shù)則有較大的正面影響 . 9x ～ 10x 分別為ELPs 的分子量、 ELPs 每一單體的 Xaa 數(shù)量。而 ELPs 濃度對 ELPs 相變溫度沒有影響，故為相關系數(shù)零。 由此模型可知，偽氨基酸組的相關系數(shù)對 ELPs 的相變溫度影響較大。當 ELPs濃度較高時，其濃度在一定范圍變化對相變溫度幾乎不影響，這與 Chilkoti 等 [16]所報道的結(jié)果較為一致。 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 13 圖 ：使用最小中位方差回歸獲得的擬合值與實測值關系 Fig . Relationship between experimental and fitted transition temperature obtained by Least Median of Squares Regression 由圖 可知，經(jīng)最小中位方差回歸獲到的一些擬合值非常好，而另外一些預測值與實測值差距比較大，從而導致其回歸直線的斜率偏離較大。 利用支持向量機預測相變溫度 如前所述， ? =8 為氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)最佳運行參數(shù)，利用 UD 對支持向量機運行參數(shù)進行優(yōu)化，經(jīng)交叉驗證后，其結(jié)果如表 所示： 表 ：支持向量機運行參數(shù)的選擇 Table : Selection of running parameters of SVM Number C epsilon Gamma MAE MSE MPAE R1 10 5 R2 1 R3 R4 1 R5 50000 R6 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 14 R7 100 R8 10000 R9 50 R10 R11 R12 5 R13 500 1 R14 5000 R15 1000 default 1 由表 可得出，三個誤差特征指標在交叉驗證中變化的幅度較小，這說明 SVM對運行的參數(shù)不是很敏感。當懲罰系數(shù) C=100， epsilon 為 ， Gamma 為 (即方案 7)時， MAE、 MSE 及 MPAE 均最小，分別為 ， 和 型對 ELPs 相變溫度預測準確率最高，故為最佳方案。 在方案 7 中，使用用支持向量機方法建立的相變溫度模型，通過該模型對實際測得的數(shù)據(jù)進行預測，預測的效果見圖 。模型預測的結(jié)果與實際測量值的相關系數(shù)達 ，模型預測的結(jié)果較好。 圖 ：使用支持向量機獲得的預測值與實測值關系 Fig2: Relationship between experimental and predicted transition temperature obtained by SVM 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 15 利用神經(jīng)網(wǎng) 絡預測相變溫度 對神經(jīng)網(wǎng)絡而言，由于訓練樣本集的大小有限，網(wǎng)絡訓練后對訓練集外的輸入的響應如何，直接決定了網(wǎng)絡的性能。為了檢驗所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡的可靠性，對其進行 3 因素 9 水平交叉驗證。結(jié)果如表 所示。表中三個特征值變化幅度較大，說明神經(jīng)網(wǎng)絡對運行參數(shù)比較敏感。在 9 組驗證中，采用默認參數(shù)獲得的特征值最好，即隱含層節(jié)點數(shù)為 6，學習速率為 ，動態(tài)參數(shù)為 時，其準確率最高，其MAE、 MSE 及 MPAE 均最小，分別為 、 和 。 表 ：神經(jīng)網(wǎng)絡運行參數(shù)的選擇 Table :Selection of running parameters of BP neural work Number The learning rate Momentum parameter The neuron numbers of the hidden layer MAE MSE MPAE% N1 8 N2 10 N3 13 N4 17 N5 5 N6 11 N7 15 N8 3 N9 6 default 6 用 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡建立的相變溫度模型，通過該模型對實際測得的數(shù)據(jù)進行預測，預測的結(jié)果見圖 ，此線性回歸方程是為： ?? 。 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 16 圖 :使用 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡獲得的預測值與實測值關系 Fig : Relationship between experimental and predicted transition temperature obtained by BP neaural work 由圖 至 中可知， BP 神經(jīng)網(wǎng)絡所建立的預測相變溫度的精度，比使用 支持向量機和最小中位方差回歸建立的相變溫度要好，可作為后續(xù)使用的模型。 從上述三圖還可知，當實測的 ELPs 相變溫度為 60℃（此時 ELP 的序列最短濃度最高）與三種算法所預測（回歸的結(jié)果是擬合）出來相變溫度值均差距較大，這可能當序列較短時， ELPs 在濃度的變化與長度的變化對相變溫度影響更大 [4]，而 ELP的序列組成對相變溫度影響較小。 與傳統(tǒng)的擬合方法預測 ELPs 的相變溫度相比，基于支持向量機和神經(jīng)網(wǎng)絡對相變溫度進行預測，不用通過預測相變溫度具體形式，直接從數(shù)據(jù)中得到相變溫度與ELPs 序列、分子量、 Xaa 組成、 濃度之間的關系，同時加以一定的先驗知識，能夠更大范圍地反應它們之間的關系，其應用的范圍也更廣闊。 小結(jié) 基于 Chou 提出的偽氨基酸概念，考慮了 ELPs 的氨基酸組成極為相似，構造了一種 ? 維的偽氨基酸組成來表示蛋白質(zhì)序列，最小中位方差回歸、支持向量機、 BP神經(jīng)網(wǎng)絡被用來作為預測的工具，結(jié)果表明當 ? =8 為氨基酸相關系數(shù)的階數(shù)最佳運行參數(shù)，而使用 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡所建立的相變溫度預測模型為最佳。 華僑大學碩士研究生畢業(yè)論文 17 第三章 類彈性蛋白多肽的從頭設 計、非色譜純化及鹽效應研究 與常規(guī)的色譜分離方法相比，使用 ELPs 來純化重組蛋白純化具有很大優(yōu)勢。但是幾乎所有公布有 ELPs 序列只有兩種類型純化標簽，這兩種類型純化標簽表達與純化效率均不高，如純化時須加 2 M 的 NaCl 使 ELPs 相變溫度降低到理想狀態(tài)。本章通過設計一新型 ELPs 純化標簽，具有更低的相變溫度及對鹽更敏感，有望開發(fā)成純化標簽。其設計原理參考文獻 [56]。 ELPs[KV8F20]的表達策略 ELPs 的命名 ELP[XiYjZkn] 代表整個 ELPs 序列中有 n 個五肽，五肽中 第四個氨基酸殘基組成比例為 X︰ Y︰ Z =i︰ j︰ k[57]。如 ELP[KV8F20]，是一個包含 20 個 VPGXG 五肽單元序列，五肽單元第四個氨基酸殘基組成為 K、 V、 F，且五肽單元第四個殘基中含 2 個 K， 16 個 V， 2 個 F，比例為 1︰ 8︰ 1。 表達載體及宿主的選擇 圖 pET表達系統(tǒng)在大腸桿菌中的表達原理示意圖 Expression principle of pET expression system in 本研究采用質(zhì)粒 pET22b(+)構建表達載體 pET22bELPs， pET22b(+)質(zhì)粒載體具有氨芐青霉素抗性 (Ampr)。 E. coli BL21(DE3