【文章內容簡介】 程資源， 盡可能地實施好該實驗的教學。通過組織學生進行植物組培實驗，并希望通過一系列的再探究實驗，為今后我校和其他學校實施好本實驗的教學，提供如實驗材料的選取 、實驗方法的優(yōu)化等方面的借鑒。 實 驗 過 程 植物組織培養(yǎng)實驗是從 2021 年 9 月份開始開展的，期間經歷了多次失敗。通過不斷的總結和重復實驗，在大學老師的建議和指導下，我們終于培養(yǎng)出植物（山芋）的愈傷組織。 （植物組織培養(yǎng)正常情況要經過：外植體 愈傷組織 試管苗 移栽大田這幾個階段。 接下來，匯報我們實驗的主要過程。 第一次實驗 (2021 年 9 月 7 日 )—— 主要目的用天然培養(yǎng)基替代 MS 培養(yǎng)基 第一步 選擇適合的外植體 （植物的組織或細胞） （一）選擇外植體的基本原則 通 過查閱資料獲知，選擇外植體的基本原則是 （二）外植體的具體選擇 綜合以上原則，加上我們所掌握的知識，我們最終選擇了高中課本中提到的外植體 —— 胡蘿卜、菊花莖段。 第二步 培養(yǎng)基的制備 材料：瓊脂（實驗室所具備的是食用瓊脂） 、 米粉（主要考慮其含蔗糖且擁有大量其他營養(yǎng)物質） 水 配備過程：瓊脂 10 克（用天平稱量）加水 1000 毫升 再加米粉 20 克（按高中生物課本上的蔗糖比例）用電爐加熱融化。 15 但這樣制備 的培養(yǎng)基不能凝固（我們需要固體培養(yǎng)基，這樣才能接種），因此，我們又加了些瓊脂，約 克，這才使其凝固下來。 第三步 實驗場所和器材的消毒 實驗場所消毒：先將實驗室進行徹底清掃。再用燒杯盛一定量的冰醋酸置于石棉網上，用酒精燈加熱，對實驗室進行熏蒸。因為實驗室面積較大，我們用了兩個類似裝置。 實驗器材消毒：燒杯、錐形瓶、橡皮塞等用高壓滅菌鍋滅菌，按照說明書，控制壓強在 倍大氣壓之間，加熱 4 分鐘。這需要同時注意時間和滅菌鍋上的壓力表。因為滅菌鍋較小，所以分批進行，非常耗時。其他如剪刀、鑷子等 用酒精擦洗后放在酒精燈上灼燒（這一步是接種時完成的，因為每次用前都要反復消毒）。 第四步 外植體的消毒與預處理 我們先將胡蘿卜切成 1 厘米的圓片再消毒，但比照書上后改為切成 10 厘米的小段再消毒后切片（這是防止消毒過程中殺死外植體），胡蘿卜取用韌皮部部分。 先置于 75%的酒精中 30 秒，用飲用純凈水沖凈后再置于 HgCl2 中 30秒。 再用飲用純凈水沖凈后切成 1 立方厘米的小塊備用。 另取菊花帶芽嫩枝（芽可以分泌生長素），去葉，用牙刷蘸洗衣粉輕輕刷洗 3 分鐘，再用流水沖凈。再置于 HgCl2 中 2 分鐘，用飲用純凈水洗 凈后備用。 第五步 接種（在接種箱中進行） 將培養(yǎng)基融化后倒入錐形瓶中，用高壓滅菌鍋滅菌（這一步已完成）。待其冷卻凝固。 在接種箱中將酒精燈點燃，用鑷子鑷取已備好的外植體，傾斜錐形瓶，將外植體放入其中，每次接種前 ,用酒精燈灼燒鑷子以消毒 16 第六步 培養(yǎng) 等待長出愈傷組織 （在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)） 溫度設置為 22℃。每日觀察。 下面是幾日觀察的圖片 9 月 10日 沒有反應 9 月 11日 沒有反應 9 月 12日 沒有反應 17 9 月 15日 沒有反應 9 月 17日 沒有反應 到 10 月份各瓶仍沒有長出愈傷組織。 第一次實驗失敗了。 總結：本次實驗 盡管沒有長出愈傷組織，但很少有瓶長出雜菌，說明我們的滅菌基本符合要求，這是收獲。 失敗原因可能是培養(yǎng)基中缺少無機鹽。 第二次實驗（ 2021 年 9 月 20 日） 第一步 培養(yǎng)基的制備 ： 這一次 我們使用土壤浸出液作溶劑 （因為土壤浸出液含植物生長需要的各種化學元素 。 我們從 9 月 17 日開始制備土壤浸出液，這很費時間。 下面是制備土壤浸出液的過程 我們從 9 月 17 日開始制備土壤浸出液，這很費時間。 18 土壤溶液 過濾 制好的土壤浸出液 對上次實驗總結后，我們認為培養(yǎng)基的營養(yǎng)不夠。所以，我們改進了培養(yǎng)基的配方。除使用土壤浸出液外，我們還增加了很多營養(yǎng)物質。 清單如下：蔗糖 30 克 馬鈴薯 200 克（用高壓滅菌鍋煮爛，搗成泥） 蘋果 100 克（榨成汁） 過濾蘋果汁 王飛老師 和同學 正在制備培養(yǎng)基 另有瓊脂 25 克。以上溶于 1000ml 的土壤浸出液中。 第二步 外植體的準備 （同上次） 第三步 接種 這一次，我們選擇了較小的試管作接種容器 （可節(jié)省培養(yǎng)基，也減少被污染的機會） 。接種后，用滅過菌的棉花塞住，再用無菌濾紙包住，最后用橡皮筋扎緊。 第四步 培養(yǎng) （在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）溫度設置為 22℃。每日觀察。 下面是幾日觀察的圖片： 19 9 月 24日 沒有明顯變化，但培養(yǎng)基上部變黑了，我們認為是氧化的結果。 （蘋果內的酚類物質在酚氧化酶的催化下，被氧氣氧化成褐色的醌類物質） 9 月 25日 培養(yǎng) 基的黑化更明顯，其他基本不變。 9 月 26日 依然沒有大變化 （沒有長出愈傷組織） 實際上，第二次實驗依然沒有成功。 總結：本次實驗仍很少有試管長出雜菌，進一步說明我們的滅菌是符合要求的。失敗原因可能還是培養(yǎng)基不符合要求，另外，外植體的消毒可能也不符合要求，造成外植體死亡。 第三次實驗 (2021 年 10 月 16 日 ) 第一步 培養(yǎng)基的制備 這次我們選擇用西瓜汁替代蘋果汁，除去馬鈴薯，蔗糖用 15 克，其余不變。 我們將西瓜（特小鳳）打成汁，瓜瓤是黃色的，但我們是連瓜皮一起打成汁的，所以得到的果汁是綠 色的。我們還將瓜子收集起來，研磨并提取其中的汁液。我們用 200ml 的西瓜汁，加上瓜子提取液，再用濃縮的土壤浸出液（把 1000ml 20 濃縮為 500ml，濃縮后經過冷卻，浸出液出現了一些沉淀，于是我們就再次進行了過濾。）定容至 1000ml，以此作培養(yǎng)基的溶劑。 我們選用西瓜是因為西瓜含有豐富的無機鹽、維生素等營養(yǎng)物質，用西瓜子是因為我們推測西瓜種子中的生長素可能會對我們的實驗有幫助。 這是從 10 月 16日開始的 第二步 外植體的準備 我們選用大麗菊的帶芽莖段。 為避免外植體在消毒時遭破壞， 這一次是嚴格按照濃度和規(guī)定消毒時間來做的，并且做了 4 組實驗。 A 組只用蒸餾水清洗， B 組只用 HgCl2 清洗， C 組只用酒精清洗， D 組用 HgCl2 和酒精清洗。 第三步 接種 接種時將大麗菊的帶芽莖段剪成小段，放進錐形瓶后用解剖針將外植體撥正。每個錐形瓶中接種 4～ 6 個外植體。 第四步 培養(yǎng) （在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)） 溫度設置為 22℃。 下面是幾日觀察到的圖片 （見實驗系列照片） 10 月 23 日 沒有明顯變化。有一個培養(yǎng)基長霉了。 10 月 24 日 與昨日相比，沒有可見的變化。 10 月 27 日 有的外植體周圍出現紅酵母。 10 月 30 日 還沒有出現愈傷組織。 實驗持續(xù)到 11 月份，仍沒有出現愈傷組織。實際上，第三次實驗失敗了。 總結： 目前幾次 替代培養(yǎng)基 都 不能滿足培養(yǎng)要求。 此后，我們又進行了幾次實驗，但實驗結果都沒有出現愈傷組織。我們感覺到利用替代培養(yǎng)基很難完成實驗。后來，我們去請教了安徽師范大學生命科學學院的專家和老師后得知，植物組織培養(yǎng)實驗對培養(yǎng)基的要求很高，如營養(yǎng) 21 物質要全面， pH 和滲透壓要合理等。我們的替代培養(yǎng)基由于含有大量的天然物質，雖然營養(yǎng)物質有可能滿足，但 pH 和滲透 壓等卻很難達到要求。因此，尋求替代培養(yǎng)基是很困難的。建議我們可以通過實驗來比較利用不同的實驗材料對實驗結果的影響，以及比較使用不同濃度的植物激素對實驗結果的影響等。力求得出一些數據和結論，從而為學校今后開展植物組織培養(yǎng)實驗提供便利條件。并且，他們答應為我們提供實驗條件。 得到大學老師的支持，我們決定用教材中所說的 MS 固體培養(yǎng)基來進行植物組織培養(yǎng)實驗。經過二個多月的反復實驗，我們終于獲得了階段性的成功?？偨Y如前。 實驗過程 —— 主要研究組織培養(yǎng)怎樣選取外植體 （ 以山芋為例 ） 一、 MS 固體培養(yǎng)基的配制 （一） MS 培養(yǎng)基母液 的配制 用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基也叫 MS 固體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有 20 多種營養(yǎng)成分，包括 大量元素、微量元素、鐵鹽及有機物質四類。 為了避免每次配制時都要稱量各成分，可先將各種成分按比例配制成濃縮液（ 大量元素濃縮 10倍，微量元素、鐵鹽及有機物質都濃縮 100 倍） 制成培養(yǎng)基母液（見表 1）。母液應放在冰箱中貯存?zhèn)溆谩? 表 1 MS 培養(yǎng)基母液的配制 （單位： mg） 類別 成分 規(guī)定量 稱取 量 母液體積（ mL） 擴大倍 數 配 1 升培養(yǎng)基的吸收量（ mL） 大 量 元 素 硝酸鉀 KNO3 硝酸銨 NH4NO3 磷酸二氫鉀 KH2PO4 硫酸鎂 MgSO4 7H2O 氯化鈣 CaCl2 2H2O 1900 1650 170 370 440 19000 16500 1700 3700 4400 1000 10 100 微 量 元 素 碘化鉀 KI 硼酸 H3BO3 硫酸錳 MnSO4 4H2O 硫酸鋅 ZnSO4 7H2O 鉬酸鈉 Na2MoO4 2H2O 硫酸銅 CuSO4 5H2O 氯化鈷 CoCl2 6H2O 83 620 2230 860 25 1000 100 10 鐵 鹽 乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA 硫酸亞鐵 FeSO4 7H2O 3725 2785 1000 100 10 22 有 機 物質 肌醇 甘氨酸 鹽酸硫胺素 鹽酸吡哆素 煙酸 100 5000 100 20 25 25 500 100 10 需要說明的是，大 量元素中的氯化鈣和鐵鹽中的硫酸亞鐵不能與母液混合，否則會生成沉淀物，以致母液失效，配制時我們將其單獨裝瓶貯存。 （二）植物激素母液的配制 除了上述四種母液外，培養(yǎng)基中經常添加的各種植物激素也要配成母液貯存，臨用時按濃度定量吸取加入。生長素類常用的如 2， 4D、 IAA、 NAA 等， 細胞分裂素類常用的如 6BA 和 KT 等。由于它們大多難溶于水，因此配制方法也各不相同。本次實驗我們使用了 2， 4D 和 6BA，各自配制母液方法如下：① 2，4D 準確稱取 10mg，先用 2mL95%的乙醇溶解，然后加水定容至 100mL ，濃度為，放置冰箱內貯存?zhèn)溆?。?6BA 準確稱取 10mg，先用 2mL 的 1mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶解，然后加水定容至 100mL，濃度為 ，放置冰箱內貯存?zhèn)溆谩? （三） MS 固體培養(yǎng)基的配制 取 1000mL 燒杯一只，加大量元素 10 倍母液 100mL，微量元素 100 倍母液10mL，鐵鹽 100 倍母液 10mL，有機物質 100 倍母液 10mL，蔗糖 30g，然后加水至 1000mL，待蔗糖充分溶解后用 1mol/L 鹽酸或氫氧化鈉調節(jié) pH 為 ，加入瓊脂條 8g。最后將燒杯放在電爐上加熱，注意要用玻 璃棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底。待瓊脂完全融化后，停止加熱，加水定容至 1000mL。自然冷卻至感覺燒杯壁不燙手時，將培養(yǎng)基分裝于五只大錐形瓶中，每瓶 200mL。 二、外植體的選擇及消毒 （一）選擇適合的外植體 通過查閱資料獲知，適合的外植體有利于誘導形成愈傷組織。 （原則同前） 我們先在市場上買了 6 個山芋，放在花盆中進行沙培，培養(yǎng)溫度為 25℃ ，兩周后，長出山芋幼苗（見圖 1）。將帶有芽的山芋莖段（