【文章內(nèi)容簡介】 級報告標準掌握差3）鏡檢技術能力差4）顯微鏡存在問題 ）對技術人員復訓4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài) 第三十二 頁 ，共七十四 頁 。實驗室診斷 (zhěndu224。n)的新進展? 擴大開展液體培養(yǎng)和藥敏試驗 (sh236。y224。n)? 引入現(xiàn)代分子生物學快速檢測技術? 引入現(xiàn)代免疫學快速檢測技術第三十三 頁 ，共七十四 頁 ?，F(xiàn)代分子生物學檢測主要 (zhǔy224。o)技術? 實時 (sh237。 sh237。)熒光定量 PCR? 環(huán)介導等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP)? 分子線性探針（ Hain 技術） (2024WHO推薦 )? 基因芯片技術? GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術第三十四 頁 ，共七十四 頁 。（ ） 聚合酶鏈反應（ PCR）? PCR誕生于 1985年，由美國 Muliis等發(fā)明。 PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（ DNA）復制原理而設計的體外 DNA或核糖核酸（ RNA）擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應組成一個周期，經(jīng)過 n個周期后，理論上可以獲得 2n雙鏈 DNA分子，使 DNA特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術靈敏度高、特異性強、簡便、快速，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術不斷得到改善，新的 PCR及其衍生 (yǎn shēnɡ)技術不斷建立。 第三十五 頁 ，共七十四 頁 。實時 (sh237。 sh237。)熒光定量 PCR實時定量 PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在 PCR反應體系加入熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控 PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴增的同時可獲得 (hu242。d233。)定量的結果 .即在同一個反應體系內(nèi)完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測 ,從而省去了靶ＤＮＡ擴增后復雜的定量檢測工作。第三十六 頁 ，共七十四 頁 。實時 (sh237。 sh237。)熒光定量 PCR? 該技術的優(yōu)勢 (yōush236。)在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測 ,減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測步驟 ,也減少了人工判斷結果的主觀性，提高了結果的客觀性和可比較性。同時工作效率大大提高。? 研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與 Southern雜交和酶促化學發(fā)光技術檢測的靈敏度相似 ,但要比酶促比色法提高 10倍。第三十七 頁 ，共七十四 頁 。（ ）環(huán)介導等溫擴增基因 (jīyīn)檢測 (Loopmediatedisothermalamplification， LAMP)? 檢測是連續(xù)等溫進行的。? 擴增效率十分高，反應靈敏。? 采用 4條引物，識別 6個位點，特異性強。? 不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。? 反應不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部 (qu225。nb249。)檢測。? 利用 Bst酶的鏈置換功能進行反應。? 加入反轉錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測。第三十八 頁 ，共七十四 頁 。PurificationforUltraRapidExtraction(PURE)LAMP 方法 (fāngfǎ)PURE 方法 (fāngfǎ)216。等溫反 應216。高 擴 增效率216。高特異性216。實驗 周期短 (幾乎一個 (yīɡ232。)小 時 )216。簡單216。去除核酸 擴 增抑制因子216?？s 短 處 理 時間PretreatmentkitLAMPtestSample Lysis MixtureFilterDNA第三十九 頁 ，共七十四 頁 。LAMP檢測 (jiǎnc232。)陰性 (yīnx236。ng) 陽性 (y225。ngx236。ng)不需要離心 ,等溫 ,快速 (整個 過 程只需一個小 時 )；DNA與 SYBRGreen結 合 現(xiàn) 示 綠 色 ，Bst聚合 酶 于 30分 鐘 到一個小 時 內(nèi)可將 毫微微克 /毫升 (fg/ml)（或 500100拷 貝 /毫升）的 DNA或 RNA擴 增到 10微克左右。 第四十 頁 ，共七十四 頁 。LAMP敏感度10 100 1000NCcopies/reaction模板 (mbǎn):純 化的 TB基因 組 DNA反 應 條件 :67℃ ,40min第四十一 頁 ，共七十四 頁 。LAMP結果 (jiēguǒ)分析儀器 (y237。q236。)特點：，每隔 6秒測定反應產(chǎn)物的濁度．．．（圖像等）可以打?。?32個樣本，８聯(lián)管適用．第四十二 頁 ，共七十四 頁 。（ ）、分子 (fēnzǐ)線性探針（ Hain技術）? 原理 (yu225。nlǐ)：基于 PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應判斷結果，可以鑒定 TB和 NTM、鑒定 TB復合群、快速檢測 RIF、 INH、 EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性第四十三 頁 ，共七十四 頁 。 GenoType174。分支 (fēnzhī)桿菌 試劑 盒系列? GenoType174。MTBC （來自于培養(yǎng) (p233。iyǎng)標 本的 結 核分枝桿菌復合群菌種 間 的 鑒 定）? GenoType174。Mycobacteria Direct（來自于病人 標 本的 結 核分枝桿菌復合群，非 結 核分枝桿菌復合群的 鑒 定）? GenoType174。Mycobacterium CM（來自于培養(yǎng)物的 結 核分枝桿菌復合群，非 結 核分枝桿菌的 鑒 定）? GenoType174。Mycobacterium AS（來自于培養(yǎng)物的其他非 結 核分枝桿菌的 鑒 定）? GenoType174。MTBDRplus （ 結 核分枝桿菌利福平、異煙 肼 耐 藥 性檢測 ）? GenoType174。MTBDRsl （ 結 核分枝桿菌乙胺丁醇、 喹諾酮類、氨基糖苷 類 耐 藥 性 檢測 ）第四十四 頁 ，共七十四 頁 。技術設備TwinCubator174。 手工 (shǒugōng)雜交儀第四十五 頁 ，共七十四 頁 。自動 (z236。d242。ng)操作 全自動 (z236。d242。ng)雜交儀GTBlot174。48 或 GTBlot174。 20第四十六 頁 ，共七十四 頁 。GenoType? MTBDRplus結果 (jiē guǒ)MTBC及其對利福平和 /或異煙肼的耐藥性第四十七 頁 ，共七十四 頁 。167。適用于培養(yǎng)物和痰液。167。 檢測快速，對于直接采集 (cǎij237。)的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)小時后內(nèi)即可完成檢測；167。 檢測 INH單耐藥型 TB、 MDR和 XDR；167。 符合 WHO推薦的線性探針分析標準。GenoType? MTBDRplus/sl – 優(yōu) 點 (yōudiǎn)第四十八 頁 ，共七十四 頁 。驗證 (y224。nz