20xx年醫(yī)學(xué)專題—神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)2(編輯修改稿)
2024-11-15 13:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 —原理： 在低密度時神經(jīng)元和產(chǎn)生Ⅱ型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞不能存活 優(yōu)點(diǎn)：簡單 缺點(diǎn)：1）僅能獲得Ⅰ型膠質(zhì)細(xì)胞 2） 成纖維細(xì)胞增殖能力更強(qiáng) 3）部分Ⅰ型膠質(zhì)細(xì)胞體積變大 2 利用抗原和抗體結(jié)合原理用流式細(xì)胞儀分選獲得 3 小膠質(zhì)細(xì)胞在營養(yǎng)(y237。ngyǎng)剝奪的情況下可以生長良好,第五十二頁，共一百一十一頁。,污染(wūrǎn)細(xì)胞的去除,1 成纖維細(xì)胞的污染(wūrǎn)：為Ⅰ型星型膠質(zhì)細(xì)胞主要污染細(xì)胞（用抗纖維結(jié)合素（fibronection)的抗體鑒別） 1）預(yù)防為主；取材小于兩天鼠，腦膜驅(qū)除干凈， 2）用D纈氨酸代替培養(yǎng)基中L纈氨酸 2 小膠質(zhì)細(xì)胞的污染：1.預(yù)震蕩的方法可以驅(qū)除大部分小膠質(zhì)細(xì)胞，2. 在培養(yǎng)液加入 5mmol/l的L亮氨酸甲酯，兩小時后可殺死小膠質(zhì)細(xì)胞, 3. 讓細(xì)胞先帖壁半小時后在其他培養(yǎng)皿接種。 3 少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的污染：1 ）含血清培養(yǎng)； 2）在傳代培養(yǎng)時用抗半乳糖腦苷脂抗血清或補(bǔ)體處理,第五十三頁，共一百一十一頁。,神經(jīng)(sh233。njīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用,1受體表達(dá)研究：星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞可與傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生(fāshēng)反映。（?型膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)25種神經(jīng)配體的受體 細(xì)胞譜系的研究：研究O2A前體細(xì)胞的分化 Ⅱ型膠質(zhì)細(xì)胞分化的研究：胎牛血清中存在誘導(dǎo)O2A前體細(xì)胞分化為Ⅱ型膠質(zhì)細(xì)胞的血清因子稱為星型膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分子（astroglia –inducing molecule AIM) 。 神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞相互作用的研究：,第五十四頁，共一百一十一頁。,第五十五頁，共一百一十一頁。,GFAP,第五十六頁，共一百一十一頁。,human Schwann cells,第五十七頁，共一百一十一頁。,細(xì)胞系的生長過程： 有限(yǒuxi224。n)細(xì)胞系：原代培養(yǎng) 傳代期 衰退期 無限細(xì)胞系：滯留期 指數(shù)增長期 平臺期,三、神經(jīng)細(xì)胞(sh233。n jīnɡ x236。 bāo)系培養(yǎng),第五十八頁，共一百一十一頁。,０ ２ ４ ６ ８ １０ １２ ２４ ３４ ４４,２０ １８ １６ １４ １２ １０ ８ ６,有限(yǒuxi224。n)細(xì)胞系,無限(wxi224。n)細(xì)胞系,指數(shù)(zhǐsh249。)細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)時間（周）,原代培養(yǎng),細(xì)胞系階段,第五十九頁，共一百一十一頁。,神經(jīng)(sh233。njīng)腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng),優(yōu)點(diǎn)： 容易生長、增殖速度快、實(shí)驗(yàn)操作簡單等優(yōu)點(diǎn)； 可以用液氮長期保存； 培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化； 可以導(dǎo)入外源基因； 缺點(diǎn)：不能表現(xiàn)出神經(jīng)元分化的許多過程(gu242。ch233。ng)，不能植入人體。,第六十頁，共一百一十一頁。,神經(jīng)細(xì)胞系的建立： 1）動物誘發(fā)性神經(jīng)腫瘤分離細(xì)胞(x236。bāo)進(jìn)行培養(yǎng)（PC12） 2）將連續(xù)細(xì)胞系的細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)特殊區(qū)域分離的細(xì)胞融合。 3）利用含有癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染神經(jīng)細(xì)胞，使神經(jīng)細(xì)胞獲得永生。,第六十一頁，共一百一十一頁。,Neuroblastoma cells on glass slide,原始數(shù)據(jù)圖，顏色表示(biǎosh236。)熒光強(qiáng)度,第六十二頁，共一百一十一頁。,Neuroblastoma cells on silicon wafer,硅片Ra=20nm 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 生長(shēngzhǎng)密度很高 細(xì)胞膜電位正常 活性很高 Rh123染色 熒光照片 100X,第六十三頁，共一百一十一頁。,神經(jīng)母細(xì)胞(x236。bāo)瘤細(xì)胞(x236。bāo)貼附良好， 開始分化并且形成網(wǎng)絡(luò),第六十四頁，共一百一十一頁。,大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12的培養(yǎng)(p233。iyǎng),PC12細(xì)胞；來源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤克隆 ，其具有嗜鉻細(xì)胞瘤和腎上腺嗜鉻細(xì)胞相關(guān)的表型。可以合成兒茶酚氨，在有NGF的作用下細(xì)胞停止增殖，生長出神經(jīng)突起等特點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn)：1）相當(dāng)高的穩(wěn)定性和同質(zhì)性 2）分化程度高，對NGF有很強(qiáng)的反應(yīng) 3）已經(jīng)具備了PC12細(xì)胞的生物學(xué)特征的背景資料 所以常被廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞分化和功能(gōngn233。ng)的研究,第六十五頁，共一百一十一頁。,局限性,1 PC12 不能作為所有類型神經(jīng)元模型(m243。x237。ng) 2 不能接受形成突觸聯(lián)系， 3 在NGF處理后仍然可以繼續(xù)合成DNA 4 可能發(fā)生自發(fā)性突變和繼發(fā)性變異 5 長期培養(yǎng)可能出現(xiàn)明顯不同的細(xì)胞亞群而導(dǎo)致感性趣的表型消失，,第六十六頁，共一百一十一頁。,一、 PC12細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng) 1）培養(yǎng)液：85%RPMI1640培養(yǎng)液、10%馬血清、5%胎牛血清，也可用DMEM或 F12 2）培養(yǎng)的底物：PC12細(xì)胞對塑料和玻璃黏附能力(n233。ngl236。)較差，所以必須在培養(yǎng)前進(jìn)行底物處理：膠原、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等,第六十七頁，共一百一十一頁。,PC12細(xì)胞的培養(yǎng)(p233。iyǎng)和傳代,1）PC12細(xì)胞 增倍時間為2.5—4天 實(shí)際可710天傳代一次。 2) 傳代比例為1：3或1：4 3）換液時間為23天 每次換液約為2/3 的培養(yǎng)液 4）通過機(jī)械分離進(jìn)行(j236。nx237。ng)傳代培養(yǎng)用吸管輕輕吹打 5）必須選擇生長在膠原或著其他底物的細(xì)胞群體進(jìn)行傳代,第六十八頁，共一百一十一頁。,PC12細(xì)胞(x236。bāo)的凍存和復(fù)蘇,PC12細(xì)胞可長期凍存保種 過程： 細(xì)胞吹打從培養(yǎng)皿脫落，離心收集，并懸浮于10%DMSO的完全培養(yǎng)液中，用凍存管分裝(fēn zhuānɡ)細(xì)胞懸液，方法 為每分鐘1 176。C的速度降至60 176。C，或者放入80176。C 過夜 ，可達(dá)6個月。 長期凍存可放置于液氮罐中。 復(fù)蘇：37 176。C 水浴中快速復(fù)溫，離心漂洗去除凍存液后 重懸浮于完全培養(yǎng)液。,第六十九頁，共一百一十一頁。,PC12細(xì)胞培養(yǎng)常出現(xiàn)(chūxi224。n)的問題,1） 細(xì)胞生長不良 血清問題或 密度過低 2）細(xì)胞貼壁不良 3）對 NGF 反應(yīng)(fǎny236。ng)不良 —— 細(xì)胞群體變異、NGF 失活,第七十頁，共一百一十一頁。,神經(jīng)(sh233。njīng)生長因子（NGF)的處理,1 神經(jīng)纖維的生長研究：1） 細(xì)胞(x236。bāo)密度(2.5~10)x104 2)合適的底物處理方案:NGF可減弱細(xì)胞對塑料培養(yǎng)皿的黏附能力 3)NGF的濃度: 工作濃度為 2nmol/l儲存濃度為 250μg/ml， 溶劑為醋酸鈉緩沖液(ph=5) 溫度為80 4)作用時間 :10天左右,神經(jīng)生長速度為50 μm/d,第七十一頁，共一百一十一頁。,2 神經(jīng)纖維再生: 研究NGF對神經(jīng)再生的作用。 方法： NGF預(yù)處理一周 吹打(chuīdǎ) 離心 ，去上清液 并重新接種，可2~3天重新形成網(wǎng)絡(luò)，可凍存長期保存。 3 NGF去除： 研究NGF作用 方法：1）先更換培養(yǎng)液46次，間隔培養(yǎng)數(shù)小時再換2次，吹打細(xì)胞，離心漂洗4次，再接種。2） 用抗NGF血清,第七十二頁，共一百一十一頁。,第七十三頁，共一百
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