【文章內(nèi)容簡介】 浸蠟、包埋和切片。此法可保存組織內(nèi)的可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，減少抗原的丟失。用于免疫熒光標記、免疫酶標記和放射自顯影。（二）冰凍切片法冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用廣泛，對臨床快速病理診斷尤其具有重要意義。另外，因冰凍切片制作時不經(jīng)各級酒精的脫水，二甲苯的透明等過程，因此對脂肪和類脂的保存較好，在進行脂肪染色和神經(jīng)組織髓鞘的染色常用。冰凍切片多用于新鮮組織，甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。組織不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺上冷卻后進行切片。1．恒冷箱切片 將組織塊在恒冷箱的切片機上切片。恒冷箱切片機的種類較多，可根據(jù)實際情況加以選用。一般調(diào)節(jié)溫度為－25℃左右。箱內(nèi)溫度下降后，打開觀察窗，將組織固著器放置到速凍臺上，先放少量OCT或羧甲基纖維素，待凍結(jié)后將組織塊放上，并在其周圍加適量包埋劑，將組織塊包埋。組織凍結(jié)后，將組織固著器裝到切片機上，調(diào)整組織的切面與刀刃平行并貼近刀刃，將厚度調(diào)至適當(dāng)位置后，關(guān)閉觀察窗。初步修出組織切面后，放下抗卷板，開始切片。切出切片用載玻片貼附后，進行吹干或固定。這種切片用于科研和教學(xué)的連續(xù)切片，效果較好。在切片前，應(yīng)預(yù)先啟動進行預(yù)冷，同時準備多個冷卻臺，用于多塊組織切片。2．半導(dǎo)體制冷冰凍切片法 組織塊放置在半導(dǎo)體制冷臺上，加少許蒸餾水，調(diào)好切片的厚度。接通循環(huán)流水后，再接通電源，而且在使用的全過程中流水不能中斷，關(guān)閉電路后，才能停水。還應(yīng)注意電源正負極不能接反，用整流電源控制溫度。冰凍組織周圍的水不宜過多，用手檢查組織塊的硬度，當(dāng)可切成厚薄一致的切片時，即可切片。切片用毛筆展平后，立即用載玻片貼附，待切片剛要融化時，即刻入固定液內(nèi)固定1min。已固定的組織切片，收集于清水中。根據(jù)目的進行染色。暫時不染色的切片，用載玻片吸附。3．甲醇制冷器 制冷箱為附有帶導(dǎo)管的制冷臺和制冷刀的甲醇循環(huán)裝置，其冷卻速度較快，屬開放式，做一般常規(guī)冰凍切片用。4．二氧化碳冰凍法 將組織塊用蒸餾水洗后，放在冰凍切片機的冷凍臺上，加蒸餾水少許。打開冷凍臺的二氧化碳開關(guān)，二氧化碳氣體噴出，待組織出現(xiàn)冷霜時，關(guān)閉二氧化碳，即可切片。組織冷凍過硬易碎，若冷凍不夠，組織塊硬度不足，切片呈粥糜狀，無法成片，應(yīng)用間歇冷卻法繼續(xù)冷卻。硬度一般在剛開始解凍時最適合，應(yīng)迅速切片。5．冰凍切片粘片法冰凍切片粘片法基本按石蠟切片的粘片處理，但烤片溫度不宜超過40℃?？靖珊罅⒓慈〕觯瑴囟冗^高，時間過長，則切片易碎?？靖珊笥?0%酒精和自來水略洗后即可染色。九、蘇木精－伊紅染色方法蘇木精伊紅染色方法，簡稱HE染色方法，是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的細胞與組織學(xué)最廣泛應(yīng)用的染色方法。在病理學(xué)實驗室中稱為常規(guī)染色方法。病理細胞和組織學(xué)的診斷，教學(xué)和研究都是用HE染色方法觀察正常和病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此病理學(xué)工作者必需學(xué)習(xí)和掌握這種染色方法。（一）HE染色的基本原理1．細胞核染色的原理細胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性染料以離子鍵或氫鍵結(jié)合而染色。蘇木精在堿性染料中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。2．細胞漿染色的原理細胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì)，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。伊紅是細胞漿的良好染料。隨著科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展和電子計算機的廣泛應(yīng)用，染色自動儀器的出現(xiàn)，許多實驗室已用全自動染色機代替人工染色。（二）人工操作蘇木精伊紅染色方法1．染色步驟 。無水乙醇洗去二甲苯1min2次。95%酒精1min。90%酒精1min。85%酒精1min。自來水洗2min。蘇木精染色1min至5min。自來水洗1min。1%鹽酸酒精分化20s。自來水洗1min。稀氨水（1%）反藍30s。自來水洗或蒸餾水洗1min。伊紅染色20s至5min。自來水洗30s。85%酒精脫水20s。90%酒精30s。95%I酒精1min。95%II酒精1min。無水乙醇I 2min。無水乙醇II 2min。二甲苯I 2min。二甲苯II 2min。二甲苯III 2min。中性樹膠或加拿大樹膠封片。2．染色結(jié)果細胞核呈藍色，細胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細胞和嗜伊紅顆粒呈不同程度的紅色。鈣鹽和各種微生物也可染成藍色或紫藍色。（三）自動染色機蘇木精伊紅染色程序1．二甲苯I 10min。2．二甲苯II 10min。3．無水乙醇1min。4．無水乙醇1min。5．95%酒精I 1min。6．95%酒精II 1min。7．90%酒精I 1min。8．80%酒精1min。9．自來水洗1min。10．蘇木精染色1至5min。11．自來水洗1min。12．1%鹽酸酒精分化30s。13．自來水洗5min。14．伊紅染色30s至5min。15．自來水洗30s。16．85%酒精20s。17．90%酒精30s。18．95%酒精1min。19．95%酒精1min。20．無水乙醇I 2min。21．無水乙醇II 2min。22．二甲苯I 2min。23．二甲苯II 2min。24．二甲苯III 2min。25．中性樹膠或加拿大樹膠封片。（四）冰凍切片蘇木精伊紅染色1．恒冷箱冰凍切片，粘貼在載玻片上，用95%酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自來水洗。2．蘇木精染色1～2min。3．自來水洗30s。4．1%鹽酸酒精分化20s。5．自來水洗20s。6．稀氨水30s。7．自來水洗20s。8．伊紅染色20s～1min。9．自來水洗10s。10．85%酒精20s。11．90%酒精30s。12．95%酒精1min。13．無水乙醇I 1min。14．無水乙醇II 2min。15．二甲苯I 1min。16．二甲苯II 2min。17．二甲苯III 2min。18．中性樹膠或加拿大樹膠封片。（五）染色液的配制1．蘇木精（素）蘇木精是一種純天然染料，是從蘇木素樹提煉出來的，蘇木樹主產(chǎn)墨西哥的坎偑切，蘇木精的染色性能差，經(jīng)過一百多年精心加工配制，現(xiàn)用的蘇木精配方，染色性能好，保持時間長，是世界上唯一的常規(guī)細胞核染料，2．蘇木精的配制蘇木精的配方很多，可根據(jù)不同需要選用，Harris配方最常用。（1）Harris蘇木精的配制 蘇木精1g 硫酸鋁鉀15g 無水乙醇10ml 蒸餾水200ml先用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，用無水乙醇溶解蘇木精再倒入已溶解的硫酸鋁鉀蒸餾水中，煮沸1min后，稍冷卻，繼續(xù)加熱至染液變?yōu)樽霞t色，用紗布蓋瓶口，用前濾紙過濾后每100ml加冰醋酸5ml。（2）Mayer蘇木精改良配法A液 蘇木精2g無水乙醇4