20xx年醫(yī)學(xué)專題—免疫細(xì)胞的分離與檢測(編輯修改稿)
2024-11-04 23:07 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 gyu225。n)）刺激,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化(zhuǎnhu224。)試驗原理示意,小淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)化為原始母細(xì)胞過程中，合成DNA增加，能夠吸收胸腺嘧啶核苷（3H）,第三十五頁，共七十五頁。,T細(xì)胞(x236。bāo)介導(dǎo)的細(xì)胞(x236。bāo)毒試驗 ADCC作用測定 NK活性測定,二、細(xì)胞毒檢測(jiǎn c232。)試驗,第三節(jié) 免疫細(xì)胞(x236。bāo)功能測定,第三十六頁，共七十五頁。,放射性測定(c232。d236。ng),細(xì)胞毒試驗(sh236。y224。n)原理示意,靶細(xì)胞,效應(yīng)(xi224。oy236。ng)細(xì)胞,分離上清,第三十七頁，共七十五頁。,K細(xì)胞(x236。bāo)活性測定（ADCC活性測定）,動物機(jī)體有些免疫細(xì)胞，通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）殺傷靶細(xì)胞，如NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等，這類細(xì)胞統(tǒng)稱為K細(xì)胞。 K細(xì)胞的活性不僅反映機(jī)體細(xì)胞免疫的能力，而且與體液(tǐy232。)免疫也有直接的關(guān)系。 K細(xì)胞活性檢測的方法有同位素釋放試驗法，溶血空斑法，細(xì)胞剝離法和靶細(xì)胞接合試驗。僅介紹同位素釋放法。,第三十八頁，共七十五頁。,（1）原理(yu225。nlǐ),將靶細(xì)胞用51Cr標(biāo)記后，再與特異性的IgG抗體結(jié)合，加入K細(xì)胞后即可發(fā)生ADCC效應(yīng)，引起靶細(xì)胞的溶解并釋放51Cr。用計數(shù)儀分別檢測上清和細(xì)胞沉淀中的cpm，根據(jù)上清中釋放的51Cr的多少，可判斷(p224。ndu224。n)K細(xì)胞活性的高低。,第三十九頁，共七十五頁。,（2）方法(fāngfǎ),試驗管：效應(yīng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞懸液) ，標(biāo)記的靶細(xì)胞(Cr51標(biāo)記的雞紅細(xì)胞)和亞凝集單位的抗體(兔抗雞紅細(xì)胞抗體)各0.1ml，加RPMI 1640完全培養(yǎng)基1.7ml（ADCC）。 效應(yīng)細(xì)胞對照管：效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的靶細(xì)胞各0.1ml加上述完全培養(yǎng)基1.8ml（未加抗體）。 抗體對照管：標(biāo)記的靶細(xì)胞和亞凝集單位的抗體各0.1ml，加完全培養(yǎng)基1.8ml（未加效應(yīng)細(xì)胞）。 最大釋放對照管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml 加蒸餾水 1.9ml（靶細(xì)胞會裂解，完全釋放同位素）。 自然釋放管：標(biāo)記的靶細(xì)胞0.1ml ，加完全培養(yǎng)基1.9ml（靶細(xì)胞不裂解，但可自然釋放一定量的同位素）。 以上(yǐsh224。ng)各管均置37℃5～20h后，2500g離心10min ，分別取各管上清夜1.0ml置于5支試管中，用γ計數(shù)儀測各管上清和沉淀中的cpm值。,第四十頁，共七十五頁。,（3）結(jié)果判斷(p224。ndu224。n)和計算,51Cr實驗釋放(sh236。f224。ng)率（%） 2(上清cpm—本底cpm) 100% (上清cpm本底cpm)＋( 沉淀cpm本底cpm) 51Cr 特異釋放率（%） 試驗釋放率—自然釋放率 100% 最大釋放率－自然釋放率,第四十一頁，共七十五頁。,NK細(xì)胞(x236。bāo)活性測定,NK細(xì)胞是具有天然殺傷靶細(xì)胞活性的淋巴樣細(xì)胞，其殺傷作用(zu242。y242。ng)不需要抗體、補(bǔ)體的參加，所殺傷靶細(xì)胞通常指腫瘤細(xì)胞和病毒感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這樣，可以將來源于同種動物的腫瘤細(xì)胞系或病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，作為檢測NK細(xì)胞活性的指示細(xì)胞。 NK細(xì)胞活性測定多采用51Cr釋放法試驗，其原理同細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗中所采用的51Cr釋放法試驗。在這里以檢測小鼠脾臟NK細(xì)胞活性為例，說明本試驗方法。用3HTdR摻入法，靶細(xì)胞為YAC1細(xì)胞株（小鼠淋巴瘤細(xì)胞系）。,第四十二頁，共七十五頁。,（1）試劑 小鼠脾細(xì)胞懸液:分離單個脾臟細(xì)胞裂解(li232。 jiě)紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞洗滌配置懸液（1640完全培養(yǎng)基2106/ml）。 標(biāo)記的靶細(xì)胞：活淋巴細(xì)胞（96%以上）加入H3Tdr孵育2小時/每30min振搖洗3次配成2106/ml懸液。,第四十三頁，共七十五頁。,（2）方法 試驗組孔：脾細(xì)胞懸液(淋巴細(xì)胞) ：標(biāo)記的靶細(xì)胞懸液100:1左右； 對照組：單純加標(biāo)記的靶細(xì)胞。 37℃ 5%CO2培養(yǎng)18小時（NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞）； 每孔加終濃度為0.15%的
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