【文章內(nèi)容簡介】 聚糖交聯(lián)成幾種大分子（帶適當電荷）作微載體， 利于細胞的貼壁生長。,第四十七頁，共一百一十二頁。,4.2.6.2 微載體(z224。itǐ)培養(yǎng)技術(shù),細胞支持物（微載體基質(zhì)） 應具備的特征： 1. 生物相容性； 2. 簡便的無毒害固定化 3. 良好的傳質(zhì)特性； 4.良好的機械(jīxi232。)穩(wěn)定性； 5. 最大的比表面積、 6.適合細胞生長的形狀和??； 7. 粒徑分布均一； 8. 能高壓滅菌；,9. 可重復利用，易于清洗； 10. 保護細胞(x236。bāo)免受機械損傷； 11.接種方便； 12.能固定大部分細胞； 13.適合大規(guī)模細胞培養(yǎng)； 14.細胞載體培養(yǎng)基易分離； 15.適于貼壁和懸浮培養(yǎng)；,第四十八頁，共一百一十二頁。,4.2.6.3 微囊化培養(yǎng)(p233。iyǎng)技術(shù),將細胞包裹在微囊中進行懸浮培養(yǎng)。微囊是一種人 造半透膜制成的微球體，小分子 物質(zhì)可自由穿過， 酶、輔酶、離子交換劑、活性碳、蛋白質(zhì)包裹在其中 不能逸出，催化反應底物。 20世紀80年代(ni225。nd224。i)初（Lim和Sum）制成了細胞能在其 中生長的微囊。微囊材料：海藻酸（1,4鍵連接的多 聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸）、多聚賴氨酸。,第四十九頁，共一百一十二頁。,4.2.6.4 中空纖維(xiānw233。i)法,中空纖維法：1972年（Richard Kncazek）發(fā)明。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動物細胞生存的立 體三維空間（類似于毛細血管）。 3~6層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細胞接種于空心纖 維的外腔。分離純化細胞分泌物極其方便(fāngbi224。n)。 現(xiàn)在已開發(fā)出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。,第五十頁，共一百一十二頁。,4.2.6.5 微多孔載體(z224。itǐ)培養(yǎng)技術(shù),傳統(tǒng)實心微載體的不足：只能固定貼壁細胞、后期 細胞老化而脫落、貼壁需血清中的因子幫助(bāngzh249。)。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其不足。載體內(nèi)部有網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的小孔供細胞生長、增加細胞的固定化和穩(wěn)定 化，可用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)動物細胞。 優(yōu)點：降低血清用量、易固定化、比表面積大、細 胞免受機械損傷、適合于懸浮細胞的固定化連續(xù)灌流 培養(yǎng)、也適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。,第五十一頁，共一百一十二頁。,4.2.6.5 微多孔載體培養(yǎng)(p233。iyǎng)技術(shù),微多孔載體的制作材料：生物相容性（無毒、黏 附細胞）、機械穩(wěn)定性（保證長期攪拌不破粹和清洗 處理回收利用）、熱穩(wěn)定性（高溫高壓滅菌不分解、 不破粹、不軟化）要好。 制備(zh236。b232。i)：1. 成球材料和臨時性成孔材料分散于介質(zhì) 中液滴，2. 液滴固化成小球，3. 去除（如高溫燒結(jié)） 臨時性成孔材料，形成多孔微球，4.后期處理——表 面處理、清洗、滅菌等。,第五十二頁，共一百一十二頁。,,,,,,,多孔微載體(z224。itǐ)的制備,成球材料(c225。ili224。o),分散(fēns224。n) 介質(zhì),成 球,成孔,去除球中的成孔物質(zhì),后期處理,多孔微載體,第五十三頁，共一百一十二頁。,4.2.6.5 微多孔載體的制備(zh236。b232。i)方法,材料不同、制備(zh236。b232。i)方法不同。 1. 高溫燒結(jié)法：玻璃、陶瓷等。 高嶺土、云母（成孔材料）、礬土、氫氧化鋁、 二氧化硅 → 碾細混勻，加甲基醋酸纖維素 → 漿液 →擠壓→球狀顆?！稍铩?000℃燒結(jié)幾小時→陶 瓷小顆?！?400 ℃ →熔化云母→多孔陶瓷載體。,第五十四頁，共一百一十二頁。,4.2.6.5 微多孔載體(z224。itǐ)的制備方法,2. 高分子材料成球聚和法： 水（懸浮分散介質(zhì)）加分散劑，強力攪拌→不溶 于水的單體分散成小液珠→加引發(fā)劑（油溶性） →成 珠狀小球→100~105 ℃去除未反應的單體和成孔物質(zhì)(w249。zh236。) →稀酸清洗夾在微球中的分散劑→多孔微球→氧化劑 處理使其表面極化→親水的多孔載體。,第五十五頁，共一百一十二頁。,2.4.6.5 微多孔載體的制備(zh236。b232。i)方法,3.聚合物快速凝聚法：海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液 中快速凝聚成球。 4.銳孔噴液冷凍凝固法：成球材料溶于水溶液→銳 孔噴射成小液滴→低溫疏水性物質(zhì)中→遇冷凝固→ 含冰晶的固體小球→物理化學方法(fāngfǎ)固化成球材料→ 去除小球中的冰晶，成多孔性小球。,第五十六頁，共一百一十二頁。,4.2.6.5 微多孔載體的制備(zh236。b232。i)方法,5. 油浴復相乳液分離法：油溶性成孔材料K劇烈攪拌 乳化分散到成球材料 P 的水溶液中→水包油型小液滴 →在分散到油性物質(zhì)O中→復相油滴→溶劑N（與水混 溶但不溶解P）吸出液滴中的水分→硬化成固體小球(xiǎo qi) →加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍干燥等去除成孔材料 →多孔微球。,第五十七頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),一、生物反應器： 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應器不適用于動物細胞的大量 培養(yǎng)。因為動物細胞沒有細胞壁、非常脆弱、對剪切 敏感、對培養(yǎng)環(huán)境要求嚴格。 20世紀70年代以來，細胞培養(yǎng)用反應器種類(zhǒngl232。i)越來 越多，規(guī)模越來越大。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。 國外，氣升式反應器已放大到5 000~10 000L，攪 拌式反應器達到8 000L。,第五十八頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),二、應用： 1962年以后，動物細胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴大，如今 已成為生物、醫(yī)學研究和應用領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方 法。 利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨特的 作用和意義，也是植物(zh237。w249。)、微生物細胞培養(yǎng)所無法替代 的。動物細胞的內(nèi)環(huán)境與植物微生物細胞全然不同。 動物細胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復雜的 蛋白質(zhì)（特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過程、結(jié)果等是 植物微生物細胞極少有的）；能將目的蛋白分泌到培 養(yǎng)液中，從而簡化了蛋白質(zhì)的分離、純化。,第五十九頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),二、應用：目前動物細胞生物反應器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗（HbsAg）、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗（Polio）、狂犬疫苗（Rabies）等； 非抗體(k224。ngtǐ)免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素（IFN）、白細胞 介素（IL）、B細胞生長因子（BCGF）、巨噬細胞激 活因子（MAN）、T細胞替代因子(TRF)等。 多肽生長因子：神經(jīng)生長因子（NGF）、成纖維 細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、血 清生長因子（SF）等。,第六十頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)(p233。iyǎng)的應用,酶類：組織血纖維溶酶原激活計（tPA）等； 激素：紅細胞生產(chǎn)素（EPO）、促黃體生成素 （LH）、促濾泡素（FSH）。 腫瘤特異性抗原(k224。ngyu225。n)：癌胚抗原（CEA）等； 單克隆抗體（MCAB）； 病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。,第六十一頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),三、關(guān)鍵技術(shù) （一）細胞培養(yǎng)環(huán)境(hu225。nj236。ng) 1.氨離子 2.乳酸 3.二氧化碳 4.甲基乙二醛 5.滲透壓 6.載體 （二）細胞死亡與凋亡 （三）培養(yǎng)基與細胞系 （四）過程監(jiān)控,第六十二頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),三、關(guān)鍵技術(shù)： （一）細胞培養(yǎng)環(huán)境： 氨離子(l237。zǐ)：提高細胞密度的主要限制因子是培養(yǎng)環(huán)境中抑 制因素的積累。氨的積聚（來源于培養(yǎng)基和細胞的代謝）使細 胞內(nèi)UDP氨基己糖增加，影響細胞的生長和蛋白質(zhì)糖基化過 程。應防止培養(yǎng)基中Gln自然分解和盡量去除培養(yǎng)基中的氨。 乳酸：糖代謝產(chǎn)物。高濃度乳酸→抑制乳酸脫氫酶 （LDH）活性→減少乳酸產(chǎn)生→阻止NAD的再生和丙酮酸∕乳 酸轉(zhuǎn)換→NADH 增加→抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、Gln消耗 減少→產(chǎn)能減少→抑制生長。因此應減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度（以減少乳酸）同時平衡葡萄糖與Gln的比例。,第六十三頁，共一百一十二頁。,關(guān)鍵技術(shù)——細胞培養(yǎng)環(huán)境(hu225。nj236。ng)：,二氧化碳：CO2 累積改變 細胞(x236。bāo)代謝水平、對細胞(x236。bāo)產(chǎn)生 毒性。應通過控制供氣參數(shù)，平衡氧的輸送及CO2的去除，防 止生物反應器運轉(zhuǎn)中CO2的積累。 甲基乙二醛（MG)：為丙糖磷酸去磷酸基（主要）、 脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。對細胞有潛在損傷。MG能改變氨基 酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。葡萄糖濃度很高時，MG升 高。加小牛血清可降低MG的濃度。,第六十四頁，共一百一十二頁。,關(guān)鍵技術(shù)——細胞培養(yǎng)環(huán)境(hu225。nj236。ng)：,滲透壓：高滲透壓提高細胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對數(shù) 生長期長短、細胞死亡速度。滲透壓保護劑：甘氨酸、甜菜堿 和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保護高滲對細胞生長的抑 制作用，并不影響目的蛋白的表達水平，還可使細胞長時間維 持高表達水平。 載體：用多孔微載體替代常規(guī)載體（細胞易受機械(jīxi232。)攪拌和噴氣損傷）。,第六十五頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),（二）細胞死亡與凋亡： 細胞系在生物反應器中死亡主要是細胞凋亡。 bel2基因的過量表達：能抑制Gln或缺氧引起的細 胞調(diào)亡、減少細胞特定成分的消耗、提高細胞密度(m236。d249。)和 目的蛋白的產(chǎn)量?？赏ㄟ^基因工程方法將bel2這種抑 制細胞調(diào)亡的基因?qū)爰毎?在大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)條件下，細胞死亡或凋亡 主要是：營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多。,第六十六頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),（三）培養(yǎng)基與細胞系： 培養(yǎng)基：歷經(jīng)天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基到現(xiàn)今的無 血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基：避免了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對細胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。 細胞系或細胞珠不同，其無血清培養(yǎng)基需求不同， 在細胞早期培養(yǎng)階段(jiēdu224。n)，細胞對無血清培養(yǎng)基的適應性 往往是特異性的。,第六十七頁，共一百一十二頁。,4.2.7 動物細胞生物(shēngw249。)反應器大規(guī)模培養(yǎng),（四）過程監(jiān)控： 因大量細胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會迅速改變，過程的 再線監(jiān)控是非常重要的。 離線測定：需要時間長，來不及指導控制有關(guān)參數(shù) 和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費用。 在線測定：培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物、目的(m249。d236。)產(chǎn)物等是大 規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的需要。 重要（有效）參數(shù)：溫度、pH、溶解氧濃度。,第六十八頁，共一百一十二頁。,4.2.8 動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀(xi224。nzhu224。ng)與展望,動物細胞培養(yǎng)工程目前存在的問題： 1.細胞密度低，產(chǎn)物濃度低。 2.細胞群體在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能 力易丟失，或產(chǎn)物活性易降低。 3.培養(yǎng)基、培養(yǎng)設備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。 4.目前對細胞代謝和生長動力學的研究比較欠缺。 5.在線監(jiān)測(jiān c232。)不完善，限制了優(yōu)