【正文】 u236。 sh249。)生長(zhǎng)期,穩(wěn)定期,衰亡(shuāiw225。ng)期,0 24 48 72 96 120 h,每代（群體）細(xì)胞生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期,第二十四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的基本(jīběn)技術(shù),4.2.1 體外培養(yǎng)的特點(diǎn) 4.2.2 培養(yǎng)條件和工具 4.2.3 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)技術(shù) 4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù) 4.2.5 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法(fāngfǎ) 4.2.6 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 4.2.7 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) 4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)狀與展望,第二十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.1 體外培養(yǎng)(p233。iyǎng)的特點(diǎn),動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求苛刻：氨基酸（細(xì)胞是不能自 主合成必須氨基酸的）、單糖（能源；合成某些氨基 酸、脂肪(zhīf225。ng)、核酸的原料）、維生素（輔酶、輔基）、 其他大量和微量元素、促生長(zhǎng)因子和激素（促進(jìn)細(xì)胞 生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能、保持細(xì)胞分化和未分化狀態(tài)） 培養(yǎng)環(huán)境條件要求嚴(yán)格：溫度、滲透壓（多數(shù) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞260~320mOsm∕kg）、pH（及溶氧量 CO2和HO）的相對(duì)恒定、剪切力等。 易污染、防污染：細(xì)菌、真菌、病毒；血清和 組織材料。,第二十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件和工具,一、培養(yǎng)條件： 1. 溫度： 2. pH： 3. 氣體： 4. 營(yíng)養(yǎng)： 二、培養(yǎng)工具(gōngj249。)： 1. 器皿： 2. 載體：,第二十七頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)條件(ti225。oji224。n)和工具,一、培養(yǎng)條件： 溫度：多數(shù)哺乳動(dòng)物37℃，偏離則影響代謝和 生長(zhǎng)(shēngzhǎng)。高溫對(duì)細(xì)胞的威脅更大。 pH：最適7.2~7.4，低于高于7.6影響生長(zhǎng)甚 至死亡。 氣體：容器空間中O2和CO2細(xì)胞代謝的進(jìn)行。 O2 ？ CO2 ？ CO2培養(yǎng)箱？ 營(yíng)養(yǎng)：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生長(zhǎng)因子。,第二十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,1. 天然培養(yǎng)基（natural medium）：來(lái)自動(dòng)物體液 或組織分離提取的培養(yǎng)基。 種類(lèi)：生物性液體（如血清）、組織浸液（如胚胎 浸液）、凝固劑（如血漿(xu232。jiāng)）等。 （1）血清：主要為牛（胎牛、新生牛、小牛）、 馬、雞、兔、羊、人血清。各有特點(diǎn)。含各種血漿蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長(zhǎng)因子及無(wú) 機(jī)物等，在生理平衡下促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。成分復(fù) 雜，不同 種類(lèi)、不同廠家、不同批號(hào)作用有有差異。,第二十九頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)條件(ti225。oji224。n)——天然培養(yǎng)基,血清提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增殖必須的激素與生長(zhǎng) 因子(yīnzǐ)：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類(lèi)固醇激素（雌二 醇、孕酮、睪酮）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、 表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血小板生長(zhǎng)因子（PDGF） （2） 鼠尾膠原及其他膠原：細(xì)胞附著、生長(zhǎng)的 基質(zhì)，利于組織（特別是上皮類(lèi)）細(xì)胞的固定。 （3）雞胚浸出液：含生長(zhǎng)因子、核蛋白、氨基 酸等，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。 （4）水解乳蛋白：氨基酸含量高。用于原代和 細(xì)胞系的培養(yǎng)。,第三十頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基（synthetic medium）：給細(xì)胞提供近 似體內(nèi)(tǐ n232。i)的生理環(huán)境，且便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化。但不是完 全培養(yǎng)基，只能維持細(xì)胞不死而不能促進(jìn)細(xì)胞分裂。 使用時(shí)需加天然培養(yǎng)基。 （1）基本培養(yǎng)基（essential medium）：人工合成 的只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存（添加天然培養(yǎng)基后 細(xì)胞才能繁殖）的培養(yǎng)基。也稱通用培養(yǎng)基（可用于 許多細(xì)胞）。低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要含：無(wú)機(jī)鹽、微 量元素、氨基酸、維生素、碳水化合物等?，F(xiàn)已有幾 十種，用途不同。,第三十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基： （2）無(wú)血清培養(yǎng)基（serun free medium,SFM）： 化學(xué)限定性培養(yǎng)基或化學(xué)成分明確培養(yǎng)基（chemical defined medium)。不需添加血清就可維持體外細(xì)胞 較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)理論研究中 血清的使用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（原因與結(jié)果難以對(duì)應(yīng)）。 包括兩部分(b249。 fen)： 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：合成培養(yǎng)液，如HamF12和DMEM 以及許多已商品化的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，SEM用于角質(zhì)細(xì) 胞,SFM 用于淋巴細(xì)胞，等等。,第三十二頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,無(wú)血清培養(yǎng)基的添加成分： （1）細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）： 促進(jìn)貼壁。如纖連蛋白（FN），層粘連蛋白（LN） 等。 FN促進(jìn)中胚層源細(xì)胞的貼壁和分化； LN作用于 內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層源細(xì)胞。 （2）促生長(zhǎng)因子與激素： （3）酶抑制劑：如大豆(d224。d242。u)胰酶抑制劑。（胰酶消化 傳代） （4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：如轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清 蛋白，增加黏度，免受機(jī)械損傷。,第三十三頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.3 原代培養(yǎng)(p233。iyǎng)與傳代培養(yǎng)(p233。iyǎng)技術(shù),4.2.3.1 原代培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng) 處死動(dòng)物(d242。ngw249。)，無(wú)菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼 科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取Hanks液沖下剪刀上 的碎片，補(bǔ)加35mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低 速離心，棄去上清液，留下組織塊。 組織消化培養(yǎng) （1）取材、分離、消化 消化軟組織：0.25%胰蛋白酶 消化纖維組織：膠原酶 消化傳代細(xì)胞（制成細(xì)胞懸液）：EDTA+胰蛋白酶,第三十四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,培養(yǎng)： 接種：接種量大小視情況而定；防污染；常規(guī)檢 查：12天做一次。 4.2.3.2 傳代培養(yǎng)： 原代細(xì)胞分裂增殖(zēngzh237。)成片，布滿器皿表面時(shí)，則需 對(duì)其分離進(jìn)行重新培養(yǎng)。 傳代技術(shù)的關(guān)鍵： 傳代時(shí)機(jī)：8090%匯合時(shí)最好（過(guò)早：細(xì)胞 產(chǎn)量不足 過(guò)晚：細(xì)胞健康不佳）。 2.酶消化的方法和細(xì)胞對(duì)酶的反應(yīng)：敏感/遲鈍 （酶作用時(shí)間和方法，細(xì)胞的類(lèi)型和來(lái)源）,第三十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù)(j236。sh249。),4.2.4.1 貼壁培養(yǎng)的材料： 貼壁培養(yǎng)(p233。iyǎng)：細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行培養(yǎng)(p233。iyǎng)。 （1）玻璃：明礬——硅硼膠玻璃。 （2）塑料：聚苯乙烯。 （3）金屬：不銹鋼和肽。 （4）微載體：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物,第三十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.4.2 貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)(shēngzhǎng)特性,游離期：接種的細(xì)胞，懸浮，細(xì)質(zhì)回縮變圓。 吸附期：細(xì)胞類(lèi)型不同，貼壁時(shí)間有差異。貼壁 快：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞，傳代細(xì)胞；貼壁慢：組織(zǔzhī)快，較大細(xì) 胞團(tuán)；不利于細(xì)胞貼壁的：細(xì)胞狀態(tài)不好，培養(yǎng)基pH 不正常，培養(yǎng)瓶不潔。 繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞， 此時(shí)有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，無(wú)細(xì)胞分裂。經(jīng)一段停滯，開(kāi)始分 裂。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，開(kāi)始接觸并連接成片，這 時(shí)期細(xì)胞分裂及運(yùn)動(dòng)停止。 退化期：細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁達(dá)一定密度，隨著營(yíng) 養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細(xì)胞開(kāi)始退化。,第三十七頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.5 動(dòng)物(d242。ngw249。)細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法,懸滴培養(yǎng)(p233。iyǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法,第三十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.5.1 懸滴培養(yǎng)(p233。iyǎng)法,懸滴培養(yǎng)法：將組織器官植塊接種于一蓋玻片上， 加一滴培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)蓋玻片（植塊和培養(yǎng)液懸掛）放 置于凹形哉玻片上，熔蠟密封入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。是最早 的傳統(tǒng)(chu225。ntǒng)技術(shù)（1907年Harrison創(chuàng)立）。,,懸滴培養(yǎng)(p233。iyǎng)法示意圖,第三十九頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.5.2 旋轉(zhuǎn)(xu225。nzhuǎn)管培養(yǎng)法,旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法：1933~1934年Gey 和 Lewis建立管 狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器 皿 中培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境(hu225。nj236。ng)利于細(xì) 胞組織生長(zhǎng)。 缺點(diǎn)：旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察?？蓪⑴囵B(yǎng)物 接種在載玻片上，再入旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，取載玻片觀察。,第四十頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.5.3 灌注(gu224。nzh249。)小室培養(yǎng)法,灌注小室培養(yǎng)法：最初由Burrows（1912年）設(shè) 計(jì)。載玻片——上下 壁，金屬圈——側(cè)壁，密封成小 室，其側(cè)面有液體(y232。tǐ)流入和流出口。 特點(diǎn)：液體可循環(huán)供應(yīng)。 后來(lái)的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上都參考了此 方法的原理。,第四十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.5.4 培養(yǎng)(p233。iyǎng)瓶培養(yǎng)(p233。iyǎng)法,培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：培養(yǎng)物直接接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在放 入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。最早采用的是Carrel（1923年）設(shè)計(jì) 的卡氏瓶。 與此相關(guān)的方法：載玻片加培養(yǎng)瓶法。優(yōu)點(diǎn)：避免 培養(yǎng)瓶表面粗糙對(duì)培養(yǎng)物的影響；方便染色觀察(guānch225。)和永 久保存；增加了培養(yǎng)面積。,第四十二頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.5.5 培養(yǎng)(p233。iyǎng)板培養(yǎng)(p233。iyǎng)法,培養(yǎng)板培養(yǎng)法：將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)， 放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。曾叫微量培養(yǎng)法，是最常用 的體外培養(yǎng)技術(shù)(j236。sh249。)方法。 常用的（一次性的）培養(yǎng)板：6孔、24孔、96孔 （96孔最常用）。,第四十三頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.6 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)(p233。iyǎng)技術(shù),在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，融合固定化 細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器和人工灌 流等技術(shù)而發(fā)展(fāzhǎn)起了動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。包 括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維 法、微多孔載體培養(yǎng)等。,第四十四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.6.1 懸浮培養(yǎng)(p233。iyǎng)技術(shù),少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于懸浮生長(zhǎng)型，離體培養(yǎng)時(shí) 不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以(kěyǐ)良好 生長(zhǎng)。 動(dòng)物活體組織分散、過(guò)濾、離心、純化、漂 洗，接種到適宜培養(yǎng)液中，于特定培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)。,第四十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,,,,,,,,,,,,酶消化形成(x237。ngch233。ng) 分散細(xì)胞,加培養(yǎng)液終止(zhōngzhǐ) 消化吹打分散 形成分散細(xì)胞,剪切成細(xì)快,酶消化、吹打(chuīdǎ)分散 形成細(xì)胞懸浮液,逐級(jí)稀釋,細(xì)胞懸浮液制備過(guò)程示意圖,…,第四十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,4.2.6.2 微載體(z224。itǐ)培養(yǎng)技術(shù),最初在培養(yǎng)液中加小滾瓶增加貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)面 積，此法構(gòu)造(g242。uz224。o)簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行。 但：勞動(dòng)強(qiáng)度大、滾瓶空間大而提供的面積有限、細(xì) 胞產(chǎn)率低、監(jiān)控不便。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞技術(shù)(Van Wezel,1967): 一定程度上改變了其不足、最初的載體為離子交換樹(shù) 脂微珠（60~250微米）。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的 葡