【正文】 nary phase）：因培養(yǎng)空間和營 養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物的累積，細(xì)胞進(jìn)入：新 分裂的細(xì)胞數(shù)與死亡的細(xì)胞數(shù)相等的動態(tài)平衡時期。)生 長期，群體細(xì)胞數(shù)增殖一倍所需要的時間，以時間T 表示） 積分得： T ＝ ㏑2 ∕μ (時間T表示細(xì)胞比生長 速率) 此時期細(xì)胞以指數(shù)形式增長繁殖。初代MI 低，傳代和腫瘤細(xì)胞系MI高達(dá)3~5% 。n)： 潛伏期（latent phase）： 接種——懸浮——貼附——不馬上分裂（潛伏）。ng)培養(yǎng),第一次傳代(chu225。 細(xì)胞系（cell line）：第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞。,4.1.6.1 細(xì)胞系的生長(shēngzhǎng)過程：,衰亡期（senescence phase）：細(xì)胞仍生存，但 不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡(sǐw225。 細(xì)胞系（cell line）：傳代細(xì)胞分裂增殖旺盛、能 保持一致的二倍體核型，稱細(xì)胞系。1~4周。 如：人胚成纖維細(xì)胞存活一年、傳30~50代相當(dāng)于 150~300個細(xì)胞周期）；供體是成體或衰老個體時則 存活更短；肝、腎細(xì)胞僅能傳幾代或十幾代。,第十六頁，共一百一十二頁。)時，細(xì)胞不再移動且 停止接觸區(qū)質(zhì)膜的皺褶活動和細(xì)胞運(yùn)動以及細(xì)胞的 重疊生長。u zhě)活動）、成纖維細(xì)胞生 長因子（減少3T3細(xì)胞的扁平度）。 有些(yǒuxiē)細(xì)胞既可懸浮，也可以貼附。bāo)或懸浮型細(xì)胞(x236。ng)、溫度等不同。 細(xì)胞胞體略呈多角形；細(xì)胞胞突細(xì)長形；類 似絲狀偽足。,第十一頁，共一百一十二頁。 3. 游走型細(xì)胞(wandering)： 類似巨噬細(xì)胞樣的特征。特點(diǎn)：扁平狀， 形態(tài)較為規(guī)則。 起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這種形式。ngxīn)布滿表面。,貼附型細(xì)胞(x236。多數(shù)細(xì)胞屬貼附型細(xì) 胞。,第八頁，共一百一十二頁。ini224。 4.動物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在。,4.1.2 動物細(xì)胞的特點(diǎn)(t232。)。diǎn),（一）動物細(xì)胞之間的連接特點(diǎn)： 1.緊密連接：牢固、無間隙。雜交瘤細(xì)胞能在體外懸浮情況下大 量繁殖并產(chǎn)生單克隆抗體。sh249。,4. 1.1 發(fā)展(fāzhǎn)歷史,20世紀(jì)40年代以后： 動物組織培養(yǎng)的科學(xué)家們研究重點(diǎn)集中在培養(yǎng) 基方面。,4. 1.1 發(fā)展(fāzhǎn)歷史,動物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)的起源： 19世紀(jì)所應(yīng)用的胚胎學(xué)技術(shù)。 是動物細(xì)胞工程的重要技術(shù)基礎(chǔ)：細(xì)胞融合、組織 工程、胚胎工程、干細(xì)胞工程、動物克隆、動物細(xì)胞 產(chǎn)品的大規(guī)模制備技術(shù)等等都離不開～。第四章 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture),動物體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，在體外模擬機(jī)體內(nèi)的生理 條件，建立無菌、適溫和一定的營養(yǎng)條件，使之生長 和生存，并維持其結(jié)構(gòu)(ji233。,第一頁，共一百一十二頁。 動物細(xì)胞培養(yǎng)的奠基人：美國生物學(xué)家哈里森 （1907年）用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將 蛙胚神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活幾周，有細(xì) 胞突起(tūqǐ)的生長過程。 20世紀(jì)80年代以后： 隨著基因工程技術(shù)(j236。)的迅速發(fā) 展，已能把特定的外源基因通過PCR技術(shù)擴(kuò)增幾 千倍，并可轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，使其得到高質(zhì)量的表 達(dá)。 隨著基因重組和單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，動物 細(xì)胞組織培養(yǎng)展現(xiàn)出越來越可觀(kěguān)的工業(yè)化前景。 2.間隙連接： 23nm間隙。 4.中間連接： 無橫隔、透明，間隔2030nm。diǎn),（二）動物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)： 1.動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無細(xì)胞壁。 5.原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡。n),動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：從動物體內(nèi)取出 細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境條件， 在無菌、適宜溫度(wēnd249。,4.1.4體外培養(yǎng)(p233。 2.非貼附型細(xì)胞：此類細(xì)胞體外生長不必貼壁，可 在培養(yǎng)液中懸浮生長。bāo)(anchoragedependent cell),哺乳動物大多數(shù)細(xì)胞必須附著固體表面生長。從生長表面脫落而進(jìn)入液體 的細(xì)胞通常不再生長而逐漸退化。,第十頁，共一百一十二頁。胞間緊密，單層貼壁。外形不規(guī)則。,貼附型細(xì)胞(x236。 如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,第十二頁，共一百一十二頁。 如HeLa細(xì)胞原本是一種上皮型癌細(xì)胞，但若在過酸 或過堿的條件下培養(yǎng)，可以呈現(xiàn)梭形，當(dāng)酸堿適中時 又可以恢復(fù)上皮型特征。bāo)（suspend cell）,此類細(xì)胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中 懸浮生長。,第十四頁，共一百一十二頁。,第十五頁，共一百一十二頁。腫瘤（癌）細(xì)胞無此現(xiàn)象。,4.1.6 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(shēngzhǎng)與增殖過程,、細(xì)胞系的生長過程： 培養(yǎng)(p233。 獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化（遺傳性改變）生存期則發(fā)生 變化。 細(xì)胞：移動活躍、分裂但不旺盛、相似(xiānɡ s236。細(xì)胞的代數(shù)=轉(zhuǎn) 接的次數(shù)。ng)。 細(xì)胞株（cell strain）：在經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系 中，通過單細(xì)胞培養(yǎng)或篩選法，由單細(xì)胞增殖形成的 細(xì)胞群。n d224。 原（初）代培養(yǎng)細(xì)胞：24~96 h；傳代和腫瘤細(xì)胞： 6~24 h。,第二十一頁，共一百一十二頁。持續(xù)3~5天。 細(xì)胞數(shù)不增加(zēngjiā)，但代謝還是活躍的。,細(xì)胞濃度(n243。)生長期,穩(wěn)定期,衰亡(shuāiw225。iyǎng)的特點(diǎn),動物細(xì)胞營養(yǎng)需求苛刻：氨基酸（細(xì)胞是不能自 主合成必須氨基酸的）、單糖（能源；合成某些氨基 酸、脂肪(zhīf225。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。oji224。 氣體：容器空間中O2和CO2細(xì)胞代謝的進(jìn)行。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,1. 天然培養(yǎng)基（natural medium）：來自動物體液 或組織分離提取的培養(yǎng)基。各有特點(diǎn)。,4.2.2 培養(yǎng)條件(ti225。 （4）水解乳蛋白：氨基酸含量高。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基（synthetic medium）：給細(xì)胞提供近 似體內(nèi)(tǐ n232。 （1）基本培養(yǎng)基（essential medium）：人工合成 的只能使體外培養(yǎng)細(xì)胞短暫生存（添加天然培養(yǎng)基后 細(xì)胞才能繁殖）的培養(yǎng)基。,第三十一頁，共一百一十二頁。在基礎(chǔ)理論研究中 血清的使用影響實(shí)驗結(jié)果（原因與結(jié)果難以對應(yīng)）。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。 （2）促生長因子與激素： （3）酶抑制劑：如大豆(d224。,第三十三頁，共一百一十二頁。ngw249。 4.2.3.2 傳代培養(yǎng)： 原代細(xì)胞分裂增殖(zēngzh237。,4.2.4 貼壁培養(yǎng)技術(shù)(j236。iyǎng)。 （4）微載體：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物,第三十六頁，共一百一十二頁。 繁殖期：圓形懸浮細(xì)胞貼壁后延展成極性細(xì)胞， 此時有細(xì)胞運(yùn)動，無細(xì)胞分裂。,第三十七頁，共一百一十二頁。iyǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法,第三十八頁，共一百一十二頁。ntǒng)技術(shù)（1907年Harrison創(chuàng)立）。nzhuǎn)管培養(yǎng)法,旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法：1933~1934年Gey 和 Lewis建立管 狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器 皿 中培養(yǎng)。 缺點(diǎn)：旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察。nzh249。 特點(diǎn)：液體可循環(huán)供應(yīng)。iyǎng)瓶培養(yǎng)(p233。優(yōu)點(diǎn)：避免 培養(yǎng)瓶表面粗糙對培養(yǎng)物的影響；方便染色觀察(guānch225。iyǎng)板培養(yǎng)(p233。)方法。iyǎng)技術(shù),在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)基礎(chǔ)基礎(chǔ)上，融合固定化 細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器和人工灌 流等技術(shù)而發(fā)展(fāzhǎn)起了動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。iyǎng)技術(shù),少數(shù)動物細(xì)胞屬于懸浮生長型，離體培養(yǎng)時 不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以(kěyǐ)良好 生長。ngch233。uz224。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的 葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子（帶適當(dāng)電荷）作微載體， 利于細(xì)胞的貼壁生長。)穩(wěn)定性； 5. 最大的比表面積、 6.適合細(xì)胞生長的形狀和?。?7. 粒徑分布均一； 8. 能高壓滅菌；,9. 可重復(fù)利用，易于清洗； 10. 保護(hù)細(xì)胞(x236。微囊是一種人 造半透膜制成的微球體，小分子 物質(zhì)可自由穿過， 酶、輔酶、離子交換劑、活性碳、蛋白質(zhì)包裹在其中 不能逸出，催化反應(yīng)底物。微囊材料：海藻酸（1,4鍵連接的多 聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸）、多聚賴氨酸。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動物細(xì)胞生存的立 體三維空間（類似于毛細(xì)血管）。 現(xiàn)在已開發(fā)出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。)。,第五十一頁，共一百一十二頁。b232。itǐ)的制備,成球材料(c225。,4.2.6.5 微多孔載體的制備(zh236。i)方法不同。,4.2.6.5 微多孔載體(z224。,第五十五頁，共一百一十二頁。 4.銳孔噴液冷凍凝固法：成球材料溶于水溶液→銳 孔噴射成小液滴→低溫疏水性物質(zhì)中→遇冷凝固→ 含冰晶的固體小球→物理化學(xué)方法(fāngfǎ)固化成球材料→ 去除小球中的冰晶，成多孔性小球。i)方法,5. 油浴復(fù)相乳液分離法：油溶性成孔材料K劇烈攪拌 乳化分散到成球材料 P 的水溶液中→水包油型小液滴 →在分散到油性物質(zhì)O中→復(fù)相油滴→溶劑N（與水混 溶但不溶解P）吸出液滴中的水分→硬化成固體小球(xiǎo qi)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),一、生物反應(yīng)器： 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動物細(xì)胞的大量 培養(yǎng)。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),二、應(yīng)用： 1962年以后，動物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴(kuò)大，如今 已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方 法。動物細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境與植物微生物細(xì)胞全然不同。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),二、應(yīng)用：目前動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗（HbsAg）、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗（Polio）、狂犬疫苗（Rabies）等； 非抗體(k224。,4.2.7 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)(p233。n)：癌胚抗原（CEA）等； 單克隆抗體（MCAB）； 病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。nj236。zǐ)：提高細(xì)胞密度的主要限制因子是培養(yǎng)環(huán)境中抑 制因素的積累。高濃度乳酸→抑制乳酸脫氫酶 （LDH）活性→減少乳酸產(chǎn)生→阻止NAD的再生和丙酮酸∕乳 酸轉(zhuǎn)換→NADH 增加→抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、Gln消耗 減少→產(chǎn)能減少→抑制生長。nj236。應(yīng)通過控制供氣參數(shù)，平衡氧的輸送及CO2的去除，防 止生物反應(yīng)器運(yùn)轉(zhuǎn)中CO2的積累。葡萄糖濃度很高時，MG升 高。nj236。)攪拌和噴氣損傷）。 bel2基因的過量表達(dá)：能抑制Gln或缺氧引起的細(xì) 胞調(diào)亡、減少細(xì)胞特定成分的消耗、提高細(xì)胞密度(m236。 在大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞死亡或凋亡 主要是：營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多。無血清培養(yǎng)基：避免了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對細(xì)胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。,4.2.7 動物細(xì)胞生物(shēngw249。d236。,4.2.8 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀(xi224。 3.培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。,第六十九頁，共一百一十二頁。 2.開發(fā)高密度生長、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 5.相關(guān)基因工程與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的技術(shù)研究。bāo)種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)、繁殖、擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從