【文章內(nèi)容簡介】 聚焦圖像系統(tǒng)下觀察, 結果依細胞是否出現(xiàn)熒光作出判斷。,36,第三十六頁，共七十四頁。,分化能力檢測 體外分化試驗 體內(nèi)(tǐ n232。i)分化試驗 嵌合體形成 核移植,37,第三十七頁，共七十四頁。,4.胚胎(pēitāi)干細胞的制備,1. 直接由動物體內(nèi)獲取囊胚再分離ICM的方法，這樣得到(d233。 d224。o)的囊胚數(shù)量少，質(zhì)量也可能不高，由此會影響分離ES細胞的效率。 2. 卵細胞去核培養(yǎng)、轉入體細胞核，體外培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的去透明帶囊胚，由此囊胚進一步分離得到胚胎干細胞。,38,第三十八頁，共七十四頁。,39,第三十九頁，共七十四頁。,40,第四十頁，共七十四頁。,目前已證明，小鼠、兔、羊。豬、牛等多種動物的桑 椹胚以前以及囊胚的ICM細胞具有發(fā)育的全能性，因 此桑胚胚或囊胚成為分離ES細胞的常用材料。 ES細胞的分離 早期胚胎的獲取及處理(chǔlǐ)方法 原始生殖細胞的獲取 分化抑制物的選擇, 包括：飼養(yǎng)層（feeder lopr）， 條件培養(yǎng)基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基礎培養(yǎng)基的選擇 添加物的選用,41,第四十一頁，共七十四頁。,胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）也可被稱為多能干細胞（pluripotent stem cell，PSC），是胚胎或原始生殖細胞經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后篩選出的具有發(fā)育全能性的細胞。其可以定向誘導分化為幾乎所有種類的細胞，甚至形成復雜的組織和器官，其建系、體外擴增、定向誘導分化、調(diào)控機制、細胞性能、組織重構等方面的研究將在未來(w232。il225。i)的人體發(fā)育、基因功能、藥物開發(fā)、細胞治療和組織器官替代治療中發(fā)揮重要作用，并成為組織器官移植的新資源,5.目前(m249。qi225。n)胚胎干細胞的研究,42,第四十二頁，共七十四頁。,ES細胞的應用前景及面臨(mi224。nl237。ng)的難題,1．ES細胞的應用(y236。ngy242。ng)前景 （1）ES細胞在動物克隆及人類治療性克隆中的應用 （2）在轉基因動物中的應用 （3）制備嵌合體動物,43,第四十三頁，共七十四頁。,2．ES研究面臨(mi224。nl237。ng)的難題,（1）體外培養(yǎng)ES 細胞應當(yīngdāng)是既能快速無限增殖，又呈未分化狀態(tài)。如何平衡這一對矛盾, 必須篩選適宜的培養(yǎng)條件。目前在ES細胞研究中存在著建系成功率也不高等問題, 只在小鼠中建立了穩(wěn)定的ES細胞系，家畜、人類細胞系建立的最佳條件仍無定論。,44,第四十四頁，共七十四頁。,（2）ES 細胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 細胞進行治療前必須首先體外誘導ES 細胞分化產(chǎn)生某種特異的組織細胞或設計自殺基因, 當移植的細胞向腫瘤發(fā)展時, 自殺基因能啟動自毀機制使其凋亡。但如何誘導ES細胞定向分化成單一類型的分化細胞, 是至今仍未解決的難題。因此，必須尋找各種(ɡ232。 zhǒnɡ)細胞定向誘導分化的條件和方法，以及不同干細胞的表面標志和分選技術，從而得到所需要的細胞或組織。,45,第四十五頁，共七十四頁。,（3）ES細胞真正用于器官克隆(k232。 l243。nɡ)與移植仍需要技術上的突破，因為器官的形成是一個非常復雜的三維過程, 很多器官是兩個不同胚層的組織相互作用而形成的。即便是發(fā)育完整的來自自然機體的器官, 要離體培養(yǎng)并維持其正常的生理功能目前還無法做到, 器官的體外保存和維持仍是器官移植中的難題。,46,第四十六頁，共七十四頁。,（4）最大的障礙來自于倫理學問題，特別是ES細胞應用受到倫理、法律、宗教以及社會因素的強烈反對，有些國家甚至明令禁止進行人類ES細胞研究。無論從基礎研究角度來講還是從臨床應用方面來看，人類ES細胞帶給人類的益處(y236。 chu)遠遠大于在倫理方面可能造成的負面影響，但隨著觀念的改變，人們會逐漸認識到ES細胞對臨床醫(yī)學及生物學理論研究的重要作用。,47,第四十七頁，共七十四頁。,四、成體干細胞,48,第四十八頁，共七十四頁。,目前研究(y225。njiū)的成體干細胞 （Adult Stem Cells） Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC ) Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC ) Fetal Liver Stem Cells Umbilical Cord Blood Stem Cells Neural Stem Cells “Studies suggest that stem cells in different adult tissues may be more similar than previously thought and perhaps in some cases have a developmental repertoire close to that of ES cells. ” Science, Volume 288, Number 5471, Issue of 2 Jun 2000, pp. 1660 1663,49,第四十九頁，共七十四頁。,造血(z224。o xu232。)干細胞 Hematopoietic Stem Cells，HSC，,50,第五十頁，共七十四頁。,造血干細胞作為干細胞研究(y225。njiū) 與應用的突破口,1. 造血細胞是細胞增殖分化的最佳模型。 2. 造血干／祖細胞及各系血細胞的表面標志較為清 楚，細胞表型特征可進行定量分析，且可分選。 3. 造血干細胞增殖及向各系分化的重要誘導因 子、受體、信號轉導、微環(huán)境等因素較為清楚。 4. 造血細胞發(fā)揮功能可相對游離，不需“生物支架”、 神經(jīng)、血管、外科移植等復雜的“下游(xi224。y243。u)”工藝，因 此便于直接應用于臨床。,51,第五十一頁，共七十四頁。,Schematic view of adult haematopoiesis. HSC, haematopoietic stem cell。 CLP, common lymphoid progenitor。 CMP, common myeloid progenitor. The myeloid compartment includes the cell types indicated。 however, the term 39。myeloid39。 cells in common usage usually refers to monocytes and neutrophils.,52,第五十二頁，共七十四頁。,53,第五十三頁，共七十四頁。,Isolation of Primary and Im