【正文】 s Neural Stem Cells “Studies suggest that stem cells in different adult tissues may be more similar than previously thought and perhaps in some cases have a developmental repertoire close to that of ES cells. ” Science, Volume 288, Number 5471, Issue of 2 Jun 2000, pp. 1660 1663,49,第四十九頁，共七十四頁。,四、成體干細(xì)胞,48,第四十八頁，共七十四頁。 chu)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在倫理方面可能造成的負(fù)面影響，但隨著觀念的改變，人們會(huì)逐漸認(rèn)識(shí)到ES細(xì)胞對(duì)臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)理論研究的重要作用。,（4）最大的障礙來自于倫理學(xué)問題，特別是ES細(xì)胞應(yīng)用受到倫理、法律、宗教以及社會(huì)因素的強(qiáng)烈反對(duì)，有些國家甚至明令禁止進(jìn)行人類ES細(xì)胞研究。即便是發(fā)育完整的來自自然機(jī)體的器官, 要離體培養(yǎng)并維持其正常的生理功能目前還無法做到, 器官的體外保存和維持仍是器官移植中的難題。 l243。,45,第四十五頁，共七十四頁。因此，必須尋找各種(ɡ232。,（2）ES 細(xì)胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 細(xì)胞進(jìn)行治療前必須首先體外誘導(dǎo)ES 細(xì)胞分化產(chǎn)生某種特異的組織細(xì)胞或設(shè)計(jì)自殺基因, 當(dāng)移植的細(xì)胞向腫瘤發(fā)展時(shí), 自殺基因能啟動(dòng)自毀機(jī)制使其凋亡。目前在ES細(xì)胞研究中存在著建系成功率也不高等問題, 只在小鼠中建立了穩(wěn)定的ES細(xì)胞系，家畜、人類細(xì)胞系建立的最佳條件仍無定論。ng)的難題,（1）體外培養(yǎng)ES 細(xì)胞應(yīng)當(dāng)(yīngdāng)是既能快速無限增殖，又呈未分化狀態(tài)。,2．ES研究面臨(mi224。ngy242。nl237。n)胚胎干細(xì)胞的研究,42,第四十二頁，共七十四頁。i)的人體發(fā)育、基因功能、藥物開發(fā)、細(xì)胞治療和組織器官替代治療中發(fā)揮重要作用，并成為組織器官移植的新資源,5.目前(m249。其可以定向誘導(dǎo)分化為幾乎所有種類的細(xì)胞，甚至形成復(fù)雜的組織和器官，其建系、體外擴(kuò)增、定向誘導(dǎo)分化、調(diào)控機(jī)制、細(xì)胞性能、組織重構(gòu)等方面的研究將在未來(w232。 ES細(xì)胞的分離 早期胚胎的獲取及處理(chǔlǐ)方法 原始生殖細(xì)胞的獲取 分化抑制物的選擇, 包括：飼養(yǎng)層（feeder lopr）， 條件培養(yǎng)基（conditioned medium， CM） 和分化抑制因子（differentiation inhibitory activity， DIA） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇 添加物的選用,41,第四十一頁，共七十四頁。,目前已證明，小鼠、兔、羊。,39,第三十九頁，共七十四頁。 2. 卵細(xì)胞去核培養(yǎng)、轉(zhuǎn)入體細(xì)胞核，體外培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的去透明帶囊胚，由此囊胚進(jìn)一步分離得到胚胎干細(xì)胞。 d224。i)分化試驗(yàn) 嵌合體形成 核移植,37,第三十七頁，共七十四頁。,36,第三十六頁，共七十四頁。u)PBS封片。封閉液，羊抗兔lgG。,35,第三十五頁，共七十四頁。 *結(jié)果判定陽性對(duì)照ES細(xì)胞染成棕色，陰性對(duì) 照無色。nɡ y242。yǒu)正常二倍體核型， 可用核型分析進(jìn)行檢驗(yàn),34,第三十四頁，共七十四頁。,33,第三十三頁，共七十四頁。ngt224。) 分化能力檢測(cè) 體外分化試驗(yàn) 體內(nèi)分化試驗(yàn) 嵌合體形成試驗(yàn) 核移植試驗(yàn),32,第三十二頁，共七十四頁。,3. ES細(xì)胞(x236。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。小鼠SSEA－1的表達(dá)自8一細(xì)胞期開始，直到原始外胚層形成期。bāo)表面抗原的表達(dá),早期(zǎoqī)胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA－1）。,30,第三十頁，共七十四頁。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。,堿性(jiǎn x236。 *用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重 構(gòu)胚和動(dòng)物個(gè)體。 3. ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細(xì)胞 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， *聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮 的心肌細(xì)胞。ng)維持其未分 化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。bāo)的高度分化潛能,ES細(xì)胞的全能性是其區(qū)別于成 纖維細(xì)胞等體細(xì)胞的顯著特點(diǎn) 1. ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能(c225。,28,第二十八頁，共七十四頁。 6. 此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。 4. ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時(shí)可見單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。 3. 細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質(zhì)。i s236。,ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型 1. 各種動(dòng)物的ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。n n233。,2. ES細(xì)胞(x236。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。ng)，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞； ④形成嵌合體。通過控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境(hu225。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目。,1. ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面： ①形成畸胎瘤。,A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell,24,第二十四頁，共七十四頁。)生物學(xué)?， 葉鑫生等編，2000.4）,22,第二十二頁，共七十四頁。,ES細(xì)胞(x236。,20,第二十頁，共七十四頁。由此培養(yǎng)的細(xì)胞株，證實(shí)具有全能干細(xì)胞的特征。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)另一個(gè)研究小組也從人胚胎組織中建立了干細(xì)胞株。經(jīng)測(cè)試這些細(xì)胞株的細(xì)胞表面 marker 和酶活性，證實(shí)它們就是胚胎干細(xì)胞。iy249。,1998年美國有兩個(gè)小組分別培養(yǎng)出了人多能( pluripotent )干細(xì)胞： James A. Thomson在 Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)一個(gè)研究小組從人胚胎組織中培養(yǎng)出了干細(xì)胞株。ng)干細(xì)胞 視網(wǎng)膜干細(xì)胞 胰腺干細(xì)胞,17,第十七頁，共七十四頁。,根據(jù)來源來分: 來源于胚胎(pēitāi) 胚胎(pēitāi)干細(xì)胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖細(xì)胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 來源于成體 成體組織來源的干細(xì)胞 ASC （Adultderived Stem Cel