【文章內(nèi)容簡介】 genes. A total of 49 transposons, 29 retrotransposons, 8 assumptions protein, 31 gene were found. Further information parative analysis by using NCBI ( reveals that within the positioning area, pl transcription factor was a heme oxygenase gene, participating in maize pigment regulation. From the results of other researchers who had separated related gene of anthocyanins content, pl was also located on chromosome 6. Therefore, pl transcription factor was most likely the candidate gene. The gene was not cloned with a variaty of amplification conditions in the process of gene cloning. The main reason maybe that an unkown length DNA sequence was inserted into pl transcription factor in mutant materials SDM, resulting that the gene was not cloned in SDM. Key wards： maize； anthocyanin content； QTL fine mapping； gene prediction. 第 1 章 文獻(xiàn)綜述 1 第 1 章 文獻(xiàn)綜述 QTL 精細(xì)定位策略及研究進(jìn)展 QTL 精細(xì)定位 一般情況下， QTL 的初步定位只能將其定位到染色體的一個(gè)區(qū)段范圍之內(nèi)，標(biāo)記區(qū)間的大小通常為 1030cM（ Kearsey and Farquhar 1998），在這么大的區(qū)間內(nèi)很難確定 QTL 的具體位置，也很難確定該區(qū)間內(nèi)是否只包含一個(gè) QTL，或者是幾個(gè) QTL 共同作用，從而無法將控制某性狀的基因確定出來。因 此，發(fā)展新的定位方法對(duì) QTL 進(jìn)行精細(xì)定位很有必要。就目前來說，對(duì) QTL 的精細(xì)定位主要可以從以下三個(gè)方向著手： 第一，統(tǒng)計(jì)方法的合理利用和新的統(tǒng)計(jì)方法的開發(fā)可以挖掘更多潛在的信息。首先是基于連鎖不平衡而提出的關(guān)聯(lián)分析（ Bodmer 1986），該方法不用構(gòu)建連鎖群而且解析度較高，它的精度取決于群體的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)，在人體復(fù)雜疾病的 QTL 定位中有著舉足輕重的地位，但是其在作物中的應(yīng)用較少。為了克服關(guān)聯(lián)分析假陽性較高的缺點(diǎn)， Pritchard 結(jié)合群體結(jié)構(gòu)估計(jì)與關(guān)聯(lián)分析提出了新方法（ Pritchard and Rosenberg 1999）， Yu 等人也提出了混合模型方法（ Yu et al. 20xx）。將連鎖不平衡與連鎖信息結(jié)合，精度更高而且可以直接利用 QTL區(qū)間的候選基因進(jìn)行基因互補(bǔ)檢驗(yàn)（ Wu and Zeng 20xx）。 第二，可以通過增加重組機(jī)會(huì)提高 QTL定位的精度。這包括高代回交系（ Davasi and Soller 1995； Xiong and Guo 1997）、選擇表型、輪回選擇與回交系（ Wright 1952； Hill 1998； Luo et al. 20xx； Luo and Ma 20xx） 、高代回交系（ Tanksley and Nelson, 1996）和育成品種群體（ Zhang et al. 20xx）等。其中高代回交系為沒有進(jìn)行選擇的輪回選擇與回交系，在作物精細(xì)定位中最為常用。 第三，利用次級(jí)分離群體是 QTL 精細(xì)定位最為重要的手段，初級(jí)作圖群體定位結(jié)果偏差大的主要原因是群體內(nèi)個(gè)體間遺傳背景不同，次級(jí)群體消除了遺傳背景和 QTL 間的互作感染，使得 QTL 作圖更為準(zhǔn)確。（根據(jù)與初級(jí)定位群體的關(guān)系，次級(jí)群體可以分為兩類，一類是由初級(jí)定位群體衍生而來，比如近等基因系（ Near Isogenic Lines， NILs）， QTL 等基因系（ QTL Isogenic Rebinants， QIRs）；另一類是與初級(jí)定位沒有關(guān)系的代換系群體，如單片段代換系 (Single Segment Substitution Lines, SSSLs)，染色體片段代換系 (Chromosome Segment Substitute Lines， CSSLs)，不同的次級(jí)群體的構(gòu)建過程和特點(diǎn)各不相同 (蔣洪蔚等，20xx)。如表 1： 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 表 1 不同次級(jí)群體的構(gòu)建過程及特點(diǎn) Table 1 The establishment and characterization of diffenrent secondary population 群體 構(gòu)建過程及特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) NILs 以帶有目標(biāo)性狀的供體親本與擬導(dǎo)入這一目標(biāo)性狀的受體親本進(jìn)行雜交，再用輪回親本多次回交，回交至一定世代后自交分離，即可獲得遺傳背景與輪回親本相近卻帶有目標(biāo)性狀的品系。 遺傳背景一致，精細(xì)定位準(zhǔn)確，可估計(jì)基因間上位性效應(yīng)。 一次雜交和多次回交，構(gòu)建時(shí)間長，工作量大。 QIRs 首先利用小群體采用初級(jí)定位方法完成 QTL定位，然后利用大群體進(jìn)行精細(xì)定位。大群 體的每個(gè)個(gè)體在 QTL位點(diǎn)均發(fā)生了一次重組，但在其它區(qū)域均一致。 群體容易構(gòu)建，而且可精細(xì)定位到 1cM的范圍內(nèi)。 群體大使得分子標(biāo)記檢測(cè)量大，且存在背景干擾，不能檢測(cè)到上位性效應(yīng)。 SSSLs 通過多代回交，獲得只存在供體親本的一個(gè)代換片段的差異，基因組其它部分與受體親本完全相同。 遺傳背景一致，精細(xì)定位效果好，并檢測(cè)上位性效應(yīng)。 群體構(gòu)建時(shí)間長，工作較繁瑣。 CSSLs 采用受體親本對(duì) F1進(jìn)行連續(xù)回交，然后通過對(duì)供體親本的染色體片段進(jìn)行分子標(biāo)記選擇得到的高代回交群體。 遺傳背景一致，精細(xì)定位準(zhǔn)確性較高， 可檢測(cè)上位性效應(yīng)。 構(gòu)建時(shí)間較長，工作量大。 QTL 精細(xì)定位策略 大量研究表明，影響 QTL 初級(jí)定位精確度和靈敏度的最重要因素是群體的大小。但是，在實(shí)際研究中，由于受到費(fèi)用和工作量等限制，所用的初級(jí)定位群體不可能很大。因此，無論怎樣改進(jìn)統(tǒng)計(jì)分析的方法，也無法使得初級(jí)定位的精度或分辨率達(dá)到很高，估計(jì)出來的QTL 的置信區(qū)間一般都在 10cM 以上（ Zeng 1994； Alpert and Tanksley 1996），也不能確定檢測(cè)到的 QTL 中到底是只包含一個(gè)效應(yīng)比較大的基因，還是包含數(shù)個(gè)效應(yīng)比較小 的基因（ Yano and Sasaki 1997）。也就是說，初級(jí)定位的精度還不能夠?qū)?shù)量性狀確切地劃分成單個(gè)的孟德爾因子。因此，為了使數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)被更精確地了解，在初級(jí)定位的基礎(chǔ)之上，還必須對(duì) QTL 進(jìn)行高分辨率的精細(xì)定位，也就是在目標(biāo) QTL 區(qū)域上建立更高的分辨率的分子標(biāo)記圖譜，并分析目標(biāo) QTL 與標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系。 單個(gè) QTL 的精細(xì)定位 對(duì)某個(gè) QTL 進(jìn)行精細(xì)定位，必須使用含有目標(biāo) QTL 染色體片段的代換系或近等基因系，使得除了目標(biāo) QTL 所在的染色體片段之外，基因組的其他部分全都 和受體親本相同，這樣可以最大限度地消除由遺傳背景差異帶來的干擾，從統(tǒng)計(jì)方面和遺傳方面為 QTL 的精確定位提第 1 章 文獻(xiàn)綜述 3 供了保證。 對(duì)于已經(jīng)初步定位了的主效 QTL，可以采取回交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇 (MAS，markerassisted selection)的方法，對(duì)目標(biāo) QTL 區(qū)域?qū)嵭星熬斑x擇，對(duì)其它區(qū)域?qū)嵄尘斑x擇，快速構(gòu)建染色體片段代換系或者近等基因系，用于精細(xì)定位。 Yamamoto 應(yīng)用水稻基因組染色體片段替代系，成功地對(duì)控制水稻抽穗期的 QTL 進(jìn)行了精細(xì)定位，分辨率超過 （ Yamamoto et al. 1996）。不過，這種方法特別的費(fèi)工費(fèi)時(shí)，而且只能用在效應(yīng)比較大的 QTL 的精細(xì)定位。能否在目標(biāo) QTL 區(qū)域附近找到分子標(biāo)記，是進(jìn)行精細(xì)定位的另一個(gè)限制因素（ Tanksley 1993）。為了尋找到分子標(biāo)記，往往需要做大量的篩選。例如，在對(duì)控制番茄果重的 QTL()的精細(xì)定位中，用了 600 個(gè)引物才篩選到 2 個(gè) RAPD 標(biāo)記 (Fridman et al. 20xx)。 全基因組 QTL 的精細(xì)定位 為系統(tǒng)地開展 QTL 的精細(xì)定位，往往需要構(gòu)建立一套覆蓋全基因組的相互重疊的 染色體片段代換系， 也就是在一個(gè)受體親本 的遺傳背景中構(gòu)建供體親本的“基因文庫”。代換系重疊群的建立同樣是采用多代回交的方式，但是，需要借助完整的分子標(biāo)記圖譜以及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。十字花科物種和番茄中已經(jīng)建立了此類代換系重疊群。目標(biāo)片段代換系的分析方法和單個(gè)的 QTL 精細(xì)定位相同，但是工作量很大（方宣鈞， 20xx）。 使用代換系重疊群對(duì) QTL進(jìn)行精細(xì)定位之前，必須多年多點(diǎn)對(duì)代換系進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以確定目標(biāo)代換系的代換片段上帶有控制目標(biāo)性狀的 QTL。各個(gè)目標(biāo)代換系可以分別與受體親本進(jìn)行回交，也可以在不同的目標(biāo)代換系間進(jìn)行雜 交，后者的優(yōu)點(diǎn)主要有兩個(gè)方面，一是進(jìn)一步縮小 QTL 所在位置的區(qū)間，二是可以分析不同的 QTL 之間的相互作用，因?yàn)橛幸恍?QTL 單獨(dú)存在時(shí)沒有效應(yīng)，需要與其他 QTL 共同存在或共同作用時(shí)，才能表現(xiàn)出上位性效應(yīng)。 作物 QTL 精細(xì)定位研究進(jìn)展 近年來，在 QTL 的精細(xì)定位方面已經(jīng)有大量的報(bào)道。 Yu （ Yu et al. 1991）在秈稻近等 基因系 C101A501 中定位到了一個(gè)抗稻瘟病的顯性主效基因 Pi2（ t），該基因是位于第 6 染色體的短臂上。隨后，吳金紅等（吳金紅， 20xx）將 Pi2（ t）精細(xì) 定位在標(biāo)記 RG64 和 AP22 之間，遺傳距離分別為 cM和 cM。 Dorweiler（ Dorweiler et al. 1993）使用近等基因系將控制玉米和大芻草主穗差異的基因座 TGA1，精確定位成為孟德爾基因。 Yamamoto（ Yamamoto et al. 1998）用連續(xù)重復(fù)回交選育的方法獲得了水稻抽穗期的近等基因系，將存在于第 6 染色體上的控制抽穗期的主效 QTL（ Hd1）定位于相距 cM 的分子標(biāo)記 R1697 和 P130 之間。Tanksley 使用番茄近等基因系對(duì)控制果實(shí)重量的主效 QTL 進(jìn)行了精細(xì)定位，構(gòu)建了物西南大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 理圖譜（ Tanksley et al.， 1996）。邢永忠（邢永忠等， 20xx）從重組自交系中選擇出遺傳背景高度一致的自交系配組，建立近等基因系，使位于第 7 染色體上的同一區(qū)間內(nèi)控制水稻抽穗期和株高的主效 QTL 同時(shí)以單個(gè)的孟德爾遺傳因子表現(xiàn)。精細(xì)定位這些 QTL 之后，可以憑借已經(jīng)完成測(cè)序的水稻全基因組數(shù)據(jù)庫，研究與之相對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域，以獲得包含這些QTL 的序列，便于深入研究。 Li 等（ Li et al. 20xx）使用康乃爾大學(xué)選育的熱帶粳稻品種 Jefferson 作為輪回親本，和普通野生水稻材料 IRGC105491 配置組合，利用回交群體，把控制粒重的基因 精細(xì)定位于第 3 號(hào)染色體的標(biāo)記 JL123h 和 JL109 之間，區(qū)間大小為 KB。 具有增加粒重的效果。該研究還表明，利用回交能夠排除其他微效基因的影響，增大主效 QTL 的貢獻(xiàn)率，提高定位的準(zhǔn)確度。 Xiao 等 (Xiao et al. 20xx)利用韓國的優(yōu)良栽培品種 (Hwaseongbyeo)與野生稻 IRGC105491雜交，構(gòu)建回交群體 BC3F4，將 定位于第 8 號(hào)染色體的分子 標(biāo)記 RM23201． CNR151和 RM30000． CNR99 的 KB 范圍之間，該粒重基因和水稻谷粒品質(zhì)性狀以及株高沒有相關(guān)性。 Zheng（ Zheng et al. 20xx）使用高油自交系 ASKC28IB1 作為供體親本，和低油自交系PH09B 構(gòu)建了 BC2 群體，定位到位于第 6 染色體的一個(gè)控制油分的 QTL(qHO6)。之后，又利用分子標(biāo)記輔助選擇，建立了一系列含有不同的 ASKC28IB1 重疊片段長度的近等基因系，將qHO6 定位到 SSR 標(biāo)記 UMC1145 和 SNP 標(biāo)記 MZA5002 之間，區(qū)間大 小為 cM。隨后利用SNP 標(biāo)記對(duì) 4000 株 BC5F1 群體進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該 QTL 位于 DGAT 基因的 3’端，而 3’端的唯一差異只是苯丙氨酸的插入。最后證實(shí)插入的苯丙氨酸對(duì)高油玉米油份的含量和油酸含量的提高起到了重要的作用。 作物 QTL 近等基因系的構(gòu)建及其利用價(jià)值 近等基因系的定義 近等基因系 （ nearisogenic lines， NIL） 是 指 一 個(gè) 遺傳背景相同， 除了某一兩個(gè)基因外，其他基因都相同的兩個(gè)遺傳材料 ，是經(jīng)過一系列 、長期的 回交過程 所產(chǎn)生的株系 （ Young et al，1988） 。在育種實(shí)踐 工作 中，將帶有 目標(biāo) 基因的供體親本與 作為受體的 輪回親本進(jìn)行雜交， 并多次回交 ， 每代只選擇 具