【文章內(nèi)容簡介】 同樣地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白結(jié)合代謝物，經(jīng)酸水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 SEM、 AMOZ 和 AHD。 SEM、 AOZ、 AHD 和 AMOZ 的相對分子質(zhì)量分別為 、 、 、第一章 引 言 6 ，在此質(zhì)量范圍內(nèi)， MS 噪音大，加上分析物較低的離子化效率和無特征的碎片行為， MS 檢測靈敏度很低，給定量特別是定性帶來困難 。通過采用 2NBA進(jìn)行衍生化，使得上述代謝物的衍生物 NPSEM、 NPAOZ、 NPAHD、 NPAMOZ相對分子質(zhì)量分別達(dá)到 、 、 、 ，在適當(dāng)?shù)呐鲎搽妷合戮a(chǎn)生不少于兩個特性離子的碎片峰， MS 檢測靈敏度提高，更適合于質(zhì)譜的定性和定量。 值得注意的是，許多細(xì)胞大分子也含有可反應(yīng)的氨基，需加入遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的2NBA 來確保由蛋白結(jié)合殘留釋放出的自由代謝產(chǎn)物全部衍生化。 樣品的凈化 通常，得到的水提取液或有機(jī)提取液中，目標(biāo)分析物濃度較低，還含有許多共萃取基質(zhì)，如果這些物質(zhì) 在最終的溶液中存在，不僅會干擾檢測，也會增加背景噪聲，無法測定痕量濃度的目標(biāo)分析物。樣品凈化的目的就是為了減少萃取中的共萃取基質(zhì)，濃縮目標(biāo)分析物。常用的凈化技術(shù)包括傳統(tǒng)的液液萃?。?LLP） 、固相萃取 （ SPE） 、基體固相分散技術(shù) （ MSPD） 、在線透析和微量富集技術(shù)。在實際分析中，結(jié)合多種凈化和濃縮技術(shù)來減少檢測的背景噪聲，以達(dá)到定量分析微量殘留物的應(yīng)用也很常見。 液液萃取 （ LLP） 液液萃取是最經(jīng)典、常用的凈化手段，可以用有機(jī)溶劑將待測物從溶液中萃取出來，或者將干擾物質(zhì)從有機(jī)相或水相萃取物中除 去。實驗證明，在酸性條件下，乙酸乙脂、二氯甲烷對溶液中的硝基呋喃殘留物萃取效果好，也有加入氯化鈉以進(jìn)一步提高二氯甲烷萃取效率的報道。為了達(dá)到更好的凈化效果，正己烷常被用于對樣品萃取液的進(jìn)一步脫脂。液液萃取的優(yōu)點是成本低，不需要特殊的實驗設(shè)備，其缺點是在萃取過程中有時產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，且有機(jī)溶劑消耗量大。 基體固相分散技術(shù) （ MSPD） 基體固相分散技術(shù)是將硅藻土或非極性的 C18衍生硅膠等作為吸附劑，加入到樣品中，混合均勻，或者樣品與吸附劑一同研磨，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填第一章 引 言 7 充到層析柱中，用溶劑淋洗，達(dá) 到凈化的目的，該技術(shù)可以克服液液萃取過程中產(chǎn)生乳化的問題。 [6]等和 [7]等報道了硅藻土的應(yīng)用，[8]等利用非極性的 C18衍生硅膠等作為吸附劑，成功地凈化了奶中的呋喃唑酮。 固相萃取技術(shù) （ SPE） 固相萃取技術(shù)是一種色譜凈化技術(shù)。將含待測物的溶液通過吸附層，使待測物保留在吸附層，經(jīng)洗脫除去雜質(zhì)，再選用合適的溶劑洗脫并收集目標(biāo)分析物。用固相萃取柱可以從共萃取物中凈化和濃縮硝基呋喃萃取物。有學(xué)者報道用非極性吸附劑如反相 C18或者 XAD2 可獲得高的回收率，然而在許多情況下，非極性吸附劑在從萃取物中除去干擾物的凈化過程并不理想，一些極性吸附劑例如硅膠、氧化鋁或者氨丙基材料也常常被采用，以達(dá)到更好的萃取凈化效果。 SPE 柱有多種，如 Phenomenex SDBL 反相聚合的苯乙烯 二乙烯基苯柱，基于共聚物憎水性和 ππ共軛鍵的相互作用，該柱對硝基呋喃有很強(qiáng)的選擇性保留，而大多數(shù)基質(zhì)干擾物保留較弱，能保留、洗脫硝基呋喃的 4 種待測物，效果很好。 LiChrolut EN 和 SDBL 柱可以提供相似的結(jié)果，但保留特性有少許差別。其他可供選擇的柱還有如 Waters Oasis HLB SPE、 Varian Bond Elut ENV/LMS、 Supelco Supelclean EnviChrom P、 JT Baker Bakernond H2Ophobic DVB、 IST Isolute101 等。凈化過程包括柱子活化、淋洗和洗脫。 SPE 的特點包括穩(wěn)定可靠，有更好的重現(xiàn)性和高的回收率，不會產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，可消除乳化，減少溶劑的使用，可用于大范圍內(nèi)的不同基質(zhì)。此外，還容易自動化，如自動化的 SPE： ASPEC，為滿足不同樣品萃取量的需求，有各種不同體積的柱 子可供選擇，包括碟式萃取片。此外，高通量的 96 孔板，可滿足處理大量樣品的要求。 在線透析和微量富集技術(shù) [9]等報道在線透析和微量富集技術(shù)應(yīng)用于動物源性食品肉類、奶類和蛋類中硝基呋喃的分析。方法用雙相透析膜將待測物在線分離，然后用液相色譜柱（ Bondapak C18/Corasil， 37~50μm，或者 XAD4， 50~100μm）將 4種硝基呋喃預(yù)富集，先將共萃取的基質(zhì)淋洗至廢液中，再將濃縮的分析物沖到第一章 引 言 8 分析柱上分離，用紫外檢測器檢測，可達(dá)到 1~5μg/kg的檢出限。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測方法 在國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表有關(guān)硝基呋喃類抗生素的殘留檢測方法的文獻(xiàn)中，早期的文獻(xiàn)報道大多數(shù)是檢測原藥化合物。然而由于硝基呋喃類抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點，在動物體內(nèi)的半衰期不過數(shù)小時，通常不太可能檢出原藥的殘留，例如呋喃唑酮在停藥后 12h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)在動物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，在停藥后至少 6周內(nèi) AOZ在豬肌肉組織中繼續(xù)存在 [10]，因此當(dāng)原藥濃度降至檢測限以下時，檢測其代謝物濃度是可能的。其他 硝基呋喃類抗生素也有類似特性?，F(xiàn)在各研究機(jī)構(gòu)已開始關(guān)注其代謝物的檢出，國內(nèi)外報道過用于檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘留的方法主要有色譜分析方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。 色譜分析方法 高效液相色譜法 (HPLC)在硝基呋喃類抗生素的檢測中比較常見， HPLC法所用的檢測器文獻(xiàn)報道較多的有紫外檢測器 (UV，包括二極管陣列檢測器 DAD)和電化學(xué)檢測器 (ECD)。近年來各種色譜聯(lián)用技術(shù)分析法在硝基呋喃類抗生素的代謝物的檢測中應(yīng)用較多，發(fā)展迅速，主要是與質(zhì)譜聯(lián)用（包括串聯(lián)質(zhì)譜）。 高效液相色譜法 (HPLC) （ 1） 液相色譜 紫外檢測器 (LCUV) 在硝基呋喃類抗生素原藥化合物的檢測中高效液相色譜應(yīng)用最多，而高效液相色譜最常用的檢測器就是紫外檢測器 (UV，包括二極管陣列檢測器 DAD)。通常用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定硝基呋喃類藥物代謝物時，因為呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導(dǎo)致靈敏度過低，不能滿足出口產(chǎn)品檢測硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留限量的要求 [11]。經(jīng)衍生化試劑衍生化后，產(chǎn)生強(qiáng)紫外吸收，其檢測限可以達(dá)到 1μg/kg，但是復(fù)雜的基質(zhì)會導(dǎo)致測定困難和干擾。 Angelini .等 [12]利用 LCUV方法檢測牛肌肉組織中四種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是 1mg/kg，定量限是 2mg/kg，平均回收率 76%。我國農(nóng)業(yè)部于 2021年 11月 1第一章 引 言 9 日發(fā)布農(nóng)牧發(fā) [2021]38號文件，發(fā)布了 10種動物源食品中獸藥殘留檢測方法，其中呋喃唑酮的檢測方法就是高效液相色譜法 (紫外檢測器 )。這個標(biāo)準(zhǔn)方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟組織和魚肉中呋喃唑酮殘留量的檢測，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟、魚肉組織中的檢測限分別為 50、 50、 25μg/kg，回收率分別為80%~110%、 60%~130%、 50%~140%、 70%~120%。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批間變異系數(shù) CV≤25%。 葛寶坤等 [13]采用固相萃取 (SPE)前處理凈化技術(shù)，高效液相色譜 (配有紫外檢測器 )法快速測定雞肉、魚、蝦中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量， 4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚、蝦樣品中 3個不同水平的添加回收率 (n=7)為 87%~102%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為 %~%；工作曲線的線性范圍為 5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為 2μg/kg。于慧娟等 [14]利用高效液相色譜法 (配有紫外檢測器 )測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，其方法靈敏度高，檢測限為 。由此可見，高效液相色譜 (紫外檢測器 )檢測硝基呋喃類抗生素的方法已逐漸趨于成熟，靈敏度不斷提高，檢測限能滿足國內(nèi)外水產(chǎn)品中微量呋喃唑酮測定的要求。 （ 2） 液相色譜 電化學(xué)檢測器 (LCECD) 電化學(xué)檢測器 (ECD)因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測中得到應(yīng)用。 Owen Leon [15]利用 LCECD(工作電極為玻碳電極，工作電位 ，參比電極為 Ag/AgCl電極 )檢測用含有呋喃唑酮的飼料喂養(yǎng)的雞的肝臟和胸部肌肉組織中的呋喃唑酮的殘留。 [16]利用 HPLCECD(庫侖法 )來檢測牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮。樣品經(jīng)提取凈化后，以(28∶ 72)和 %的冰醋酸為流動相，在 NovaPakC18柱上分離， CoulochemⅡ 檢測器檢測 (工作電極為多孔石墨電極，工作電位600mV)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，線性范圍在 10~60ng/ml。其中呋喃唑酮、呋喃它 酮、呋喃妥因測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù) r分別為 、 、 (Height)和、 、 (Area)。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=11)分別為 %、 %、 %(Height)和 %、 %、 %(Area)，檢測限分別為 4ng/ml(Height)和 4ng/ml(Area)。在 25ng/ml的添加回收率分別為 (85177。11)%~(97177。9)%、第一章 引 言 10 (87177。1)%~(97177。6)%、 (83177。4)%~(98177。9)%。 AlawiMA[17]利用改進(jìn)的 HPLC/ELCD高效液相色譜電化學(xué)檢測器檢測雞組織和雞蛋中的呋喃唑酮和鹽酸呋喃它酮。其回收率在 %~%。呋喃唑酮的檢測限為 1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測限為2ng/g。 聯(lián)用技術(shù)分析法 （ 1） 液相色譜 質(zhì)譜法 (LCMS) 色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機(jī)化合物的定量分析，但定性較困難；質(zhì)譜儀只能夠?qū)我唤M分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，但對復(fù)雜化合物分析無能為力。將色譜和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，對混合物中微量或痕量組分的定性和定量分析具有重要 意義 [18]。近些年來，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù) (LCMS)測定硝基呋喃類代謝物在動物組織中的殘留越來越多被采用，與用紫外檢測器的檢測方法比較，質(zhì)譜檢測器技術(shù)具有定性、定量準(zhǔn)確，抗干擾能力強(qiáng)，檢測限低，測定快速等特點 [17]。對被測化合物的確認(rèn)有很高的可信度，具有靈敏度高 (比 UV檢測器高 10倍以上 )、選擇性好、精密度高等優(yōu)點，而且 HPLCMS有易于操作和自動化的特點。 LCMS法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，可以排除酶聯(lián)免疫方法和 HPLC法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。目前 HPLCMS連用技術(shù)已 經(jīng)成為制藥業(yè)、藥物分析與研制等領(lǐng)域十分重要的分析方法，在環(huán)境分析中也起著重要作用，同時也是生物化學(xué)和生物技術(shù)大量使用的工具。近幾年國內(nèi)外采用 HPLCMS對各種藥物及其代謝物的研究取得了一定的進(jìn)展。 荷蘭瓦郝尼罕 RIKIL TDLO實驗室建立了完整的 LCMS法檢測呋喃唑酮代謝物 AOZ及其他代謝物 [19]。 HorneE等進(jìn)一步對該方法進(jìn)行改進(jìn)，利用 SPE簡化了衍生后的呋喃唑酮代謝物 NPAOZ的提取過程，再用 LCMS法進(jìn)行定性分析，對檢測豬肝中呋喃唑酮代謝物 AOZ的不同方法進(jìn)行比較研究，表明利用 HPLC法和 LCMS法測定 AOZ的結(jié)果基本相同 [20]。 Rosa Draisci等 [32]利用 HPLCDAD(光二極管陣列檢測器 )檢測雞蛋中硝基呋喃類藥物殘留并用 HPLCMS進(jìn)行確認(rèn)。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用 HPLCMS方法檢測限分別為 、 、 。Robert Kennedy[21]提出一種用 HPLCUV和 LCMS方法檢第一章 引 言 11 測動物性食品中硝基呋喃類抗生素呋喃唑酮。在溶解提取物用鋁土柱凈化后，用 HPLCUV篩選可能含有呋喃唑酮的樣品， LCMS方法用來確定證實陽性樣品。Robert Kennedy[20]利用 LCMS方法測定豬組織中呋喃唑酮的代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)，組織樣品先用甲醇 水反復(fù)溶解洗滌并用2硝基苯甲醛衍生化后分析測定。肝臟和肌肉組織的檢測限為 10ng/g，回收率大于 80%。用此方法在北愛爾蘭豬呋喃唑酮殘留事件中對 100個豬腎臟樣品進(jìn)行了測定， 7份濃度在 1~5ng/g之間， 4份小于 1ng/g，還有 1份達(dá)到 144ng/g。目前， HPLC、LCMS相關(guān)聯(lián)的 NPAOZ提取方法 已經(jīng)得到改良，并通過一系列的加標(biāo)樣品研究得以驗證。徐維海等采取 LCMS法研究呋喃唑酮及其主要代謝產(chǎn)物 AOZ在羅非魚體內(nèi)的殘留規(guī)律，利用該方法對呋喃唑酮及其代謝物 AOZ的檢出限分別為 1μg/kg[22]。 由此可見 LCMS是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)、快速的分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。但是其儀器設(shè)備的購置和運行費用較高，成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。 （ 2） 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 (LCMS/MS) 最近幾年用于檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的 LCMS/MS方法發(fā)展迅速，它是一種靈敏度更高 、選擇性更好、特異性更強(qiáng)的一種方法，歐盟目前認(rèn)為HPLCMS只能