【正文】 果計算 內(nèi)標(biāo)法定量，按 下 式 計算： 10001000i s is i i sC C A A VX C A A W? ? ? ???? ? ? 式中： X —— 試樣中待測組分殘留量， 181。用 2硝基苯甲醛 (2NBA)衍生四種代謝物，可以分別形成具有較好特性的衍生物，質(zhì)譜檢測靈敏度有很大提高。 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用 ESI正離子電離模式，通過掃描確定 4種組分的母離子 MS2及確定子離子，再采用自動和手動優(yōu)化相結(jié)合的方式對每種硝基呋喃類代謝物及內(nèi)標(biāo)物子離子進(jìn)行 CE、 DP、 EP、 CXP的化合物條件及 IE、 CUR、 NEB、 TEM、 GAS2等離子源條件的優(yōu)化，兼顧各成分的靈敏度的不同而對離子源條件有所偏重，建立了質(zhì)譜條件，見表 32，和 4種硝基呋喃代謝物及各自內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的監(jiān)測離子圖譜，見圖 33， 34， 35， 36。AOZ:) 表 31 硝基呋喃代謝物及內(nèi)標(biāo)參考保留時間 藥物名稱 保留時間 /min AMOZ AMOZD5 SEM SCA13C15N2 AHD AHD13C3 AOZ AOZD4 樣品衍生條件的優(yōu)化 四種硝基呋喃代謝物的分子量在 102~201之間，在這個質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜背景噪音很大，四種代謝物的電離效率又比較低。 定量方法 以 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比為縱坐標(biāo)，工作溶液濃度（ μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量。 （ 2）乙酸乙酯提取及 EN SPE 柱凈化（適用于高度渾濁濾液，如蝦、肝、蚌等樣品） 將 過濾后上清液加入到 LiChrolut EN 柱中，（預(yù)先用 3mL 乙酸乙酯、 3mL甲醇和 5mL 水進(jìn)行活化），用 3mL 水洗滌，壓干，直至其吸附劑的顏色由棕色變?yōu)槌壬?3mL 乙酸乙酯洗脫分析物，洗脫液經(jīng)氮氣流吹干，殘渣用 1mL 流動相溶解，過 ，供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定。 分析步驟 洗樣 稱取 177。 儀器和設(shè)備 實驗使用的主要儀器及設(shè)備 如下 ： 表 21 主要儀器和設(shè)備及其型號或容量 儀器及設(shè)備名稱 型號或容量 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜儀 Agilent1100， API4000，配有電噴霧離子源 離心機(jī) Eppendorf 5810R 高速組織搗碎機(jī) IKA T25 氮氣濃縮裝置 PIERCE MODEL 1878 快速混勻器 IKA MS2 固相萃取真空裝置 SUPELCO 公司 Eppendorf 移液器 ， ， 均質(zhì)器 UltraTurrax 恒溫振蕩裝置 MEMMER 分析天平 Shimadzu SEU210 一次性注射式濾器 配有 微孔濾膜 聚四氟乙烯離心管 50mL 棕色雞心瓶 100mL Agilent HPLC 微量進(jìn)樣瓶 pH 計 上?？祪x PHS3C 型，測量精度 177。而且國外也已經(jīng)開發(fā)出呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒。高效液相色譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)是硝基呋喃類抗生素及其代謝物的最終確證性的檢測方法。方法同 LCMS/MS方法的相關(guān)性很好， r。 在所有恒溫孵育過程中，應(yīng)避免光線照射，用試劑盒中提供的蓋板蓋住微孔板。在 450nm處 測量 (選擇參比波長 600nm)，吸光度與樣品中的 AOZ濃度成反比。羅杰、李健 [29]建立了呋喃唑酮間接競爭 ELISA檢測法，將呋喃唑酮與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白 (HAS)聯(lián)接，分別作為免疫原及包被原，建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物組織中呋喃唑酮的 ELISA篩選方法，測定的最適范圍為 10~100ng/ml，最小檢測限為 1ng/ml。目前，我國已將液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 (LCMS/MS)作為測定蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的標(biāo)準(zhǔn)測定方法(GB/)，從 2021年 8月 1日開始實施。四種硝基呋喃類抗生素代謝物 AOZ、 AMOZ、 SC、 AH的檢測限分別是 、 、 、 ，定量限分別是 、 、 、 ，測定響應(yīng)值的線性范圍從檢測限到 800ng/g之間。 由此可見 LCMS是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)、快速的分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用 HPLCMS方法檢測限分別為 、 、 。近些年來，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù) (LCMS)測定硝基呋喃類代謝物在動物組織中的殘留越來越多被采用，與用紫外檢測器的檢測方法比較，質(zhì)譜檢測器技術(shù)具有定性、定量準(zhǔn)確，抗干擾能力強(qiáng)，檢測限低，測定快速等特點 [17]。6)%、 (83177。樣品經(jīng)提取凈化后，以(28∶ 72)和 %的冰醋酸為流動相，在 NovaPakC18柱上分離， CoulochemⅡ 檢測器檢測 (工作電極為多孔石墨電極，工作電位600mV)。這個標(biāo)準(zhǔn)方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟組織和魚肉中呋喃唑酮殘留量的檢測，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟、魚肉組織中的檢測限分別為 50、 50、 25μg/kg，回收率分別為80%~110%、 60%~130%、 50%~140%、 70%~120%?，F(xiàn)在各研究機(jī)構(gòu)已開始關(guān)注其代謝物的檢出，國內(nèi)外報道過用于檢測硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘留的方法主要有色譜分析方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。 SPE 的特點包括穩(wěn)定可靠，有更好的重現(xiàn)性和高的回收率，不會產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，可消除乳化，減少溶劑的使用，可用于大范圍內(nèi)的不同基質(zhì)。 固相萃取技術(shù) （ SPE） 固相萃取技術(shù)是一種色譜凈化技術(shù)。常用的凈化技術(shù)包括傳統(tǒng)的液液萃?。?LLP） 、固相萃取 （ SPE） 、基體固相分散技術(shù) （ MSPD） 、在線透析和微量富集技術(shù)。 2NBA 是采用最多的衍生化試劑，該類衍生物在色譜柱上有較好的保留，在質(zhì)譜儀上有特征的離子碎 片，靈敏度高。粉碎后的樣品，用水、氯化鈉溶液或鹽酸溶液混合均相；奶類和蜂蜜等樣品的處理，可直接用水或鹽酸溶液混合均勻。養(yǎng)殖過程是獸藥殘留監(jiān)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，養(yǎng)殖者是動物源性食品安全的主體，其安全用藥與否直接關(guān)系到食品安全。 （ 1）加強(qiáng)培訓(xùn)與宣傳，提高安全用藥意識。 我國農(nóng)業(yè)部文 件農(nóng)牧發(fā) [2021]號也規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。這些代謝物可以在弱酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此，當(dāng)人類吃了含有硝基呋喃類抗生素殘留的食品，這些代謝物就可以在人類胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來被人體吸收而對人類健康造成危害。 （ 2）具有致癌致畸致突變。呋喃唑酮用于防治水生動物疾病，如用 1μg/kg~2μg/kg防治觀賞魚蛀鰭爛尾病和羅非魚潰爛病。在添加濃度 ~2μg/kg范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法回收率為%~%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD）小于 %。后用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，分析物采用電噴霧電離正離子（ ESI+）、多反應(yīng)檢測（ MRM）模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。其中呋喃唑酮內(nèi)服后難吸收，腸中濃度高而血中濃度低，故適用于各種腸道感染的治療，呋喃唑酮可用于治療小兒菌痢、傷寒、消化性潰瘍等疾病，呋喃唑酮的復(fù)方緩釋制劑是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的抗 HP(HP是胃潰瘍的主要致病 菌 )感染的藥物。獸醫(yī)臨床上經(jīng)常出現(xiàn)有關(guān)豬、鴨、羊、鴿子等呋喃唑酮中毒的事件報道。普通的食品加工方法 (如燒烤、微波加工、烹調(diào)等 )難以使蛋白結(jié)合態(tài)呋喃唑酮殘留物大量降解。 2021 年美國 FDA 公布了禁止在進(jìn)口動物源性食品中使用的 11 種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。但是硝基呋喃類藥物殘留超標(biāo)事件時有發(fā)生，嚴(yán)重危及動物源性食品安全和出口，因此，必須進(jìn)一步強(qiáng)化對硝基呋喃類藥物的管理。 （ 4）加強(qiáng)畜禽養(yǎng)殖的管理。盡量避免將整個樣品一次第一章 引 言 5 均相，引起酶的活性增加，從而造成分析物的損失。對衍生化試劑的選擇，許多研究者對此進(jìn)行了大量的探索，芳香醛類如 2硝基苯甲醛 （ 2NBA） 、吡啶 3羰基甲醛、 2， 4二硝基苯甲醛、 2羥基 5硝基苯甲醛和 2氯苯甲醛，均能與硝基呋喃游離代謝產(chǎn)物的自由氨基團(tuán)反應(yīng)，形成具有較好特性的芳香亞胺類衍生物。樣品凈化的目的就是為了減少萃取中的共萃取基質(zhì)，濃縮目標(biāo)分析物。 [6]等和 [7]等報道了硅藻土的應(yīng)用，[8]等利用非極性的 C18衍生硅膠等作為吸附劑，成功地凈化了奶中的呋喃唑酮。凈化過程包括柱子活化、淋洗和洗脫。其他 硝基呋喃類抗生素也有類似特性。我國農(nóng)業(yè)部于 2021年 11月 1第一章 引 言 9 日發(fā)布農(nóng)牧發(fā) [2021]38號文件，發(fā)布了 10種動物源食品中獸藥殘留檢測方法，其中呋喃唑酮的檢測方法就是高效液相色譜法 (紫外檢測器 )。 [16]利用 HPLCECD(庫侖法 )來檢測牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮。1)%~(97177。將色譜和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，對混合物中微量或痕量組分的定性和定量分析具有重要 意義 [18]。 Rosa Draisci等 [32]利用 HPLCDAD(光二極管陣列檢測器 )檢測雞蛋中硝基呋喃類藥物殘留并用 HPLCMS進(jìn)行確認(rèn)。徐維海等采取 LCMS法研究呋喃唑酮及其主要代謝產(chǎn)物 AOZ在羅非魚體內(nèi)的殘留規(guī)律，利用該方法對呋喃唑酮及其代謝物 AOZ的檢出限分別為 1μg/kg[22]。被分析物被酸性水解從組織中釋放，用 2硝基苯甲醛衍生化，利用固相萃取 (SPE)將樣品凈化。方法的檢出限為 ~，線性范圍均 102，線性方程的相關(guān)系數(shù) r，回收率為 %~%。現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道的方法也只有酶聯(lián)免疫分析法（ ELISA方法， ELISA方法的優(yōu)點是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速；缺點是仍不能實現(xiàn)在線檢測，而且假陽性率較高。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。另外幾種硝基呋喃類藥物呋喃他酮 (AMOZ)、呋喃妥因 (AHD)和硝基呋喃腙 (SEM)的藥代動力學(xué)與呋喃唑酮相似，共同的亞糠基主鏈代謝很快，而相應(yīng)的側(cè)鏈 AMOZ、 AHD和 SEM第一章 引 言 14 結(jié)構(gòu)差異較大，其 2NBA衍生物與 NPAOZ相比，其 IC50均大于 ，即以NPAOZ為基準(zhǔn)抗原，它們的交叉反應(yīng)率均低于 %，表明此 NPAOZ的蛋白抗體特異性良好 [30]。 IvaDiblikova等 [31]又制備出呋喃唑酮代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)的衍生物的高特異性單克隆抗體并建立了直接競爭 ELISA方法，其 CCβ值為 ，與已建立的確證性的 LCMS/MS方法的 。從選擇性、準(zhǔn)確性、靈敏性、穩(wěn)定性、操作難易及費用等方面綜合考慮，酶聯(lián)免疫分析法 (ELISA)是比較好的殘留檢測方法，但不能作為確證方法。 國外對硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù) ， 而且趨于成熟 ， 其檢測限能滿足歐盟的 1μg/kg的最低檢測限量的要求。液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定，內(nèi)標(biāo)法定量。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻 實驗方法 試樣制備與保存 從所取原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)搗碎，用四分法縮分出不少于 500g 試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標(biāo)記，樣品于 20℃保存。 提取和凈化 （ 1）乙酸乙酯提取 將過濾后上清液轉(zhuǎn)移至 250mL 分液漏斗中，加入 20mL 乙酸乙脂振蕩提取，靜置分層，收集上層乙酸乙酯溶液，重復(fù)操作兩次 ，合并兩次乙酸乙酯提取液，加入 15mL30%NaCl 溶液振蕩，靜置分層，棄去下層 NaCl 溶液，重復(fù)操作兩次，合并乙酸乙脂提取液于棕色雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣流吹干，精密加入 %甲酸溶液和 液態(tài)混合凈化試劑渦旋混勻 ，轉(zhuǎn)移至 15mL離心管中， 6000r/min 離心 5min，棄去下層液，再加入 液態(tài)混合凈化試劑重復(fù)操作，取上層溶液過 ，供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定。 定性方法 （ 1） 在同一天同一批次測試中，其定性離子對的提取離子流的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液或添加回收樣品的相應(yīng)離子對提取離子流的保留時間之差在 （ RT Window＝ 30s），其中 AHD RT Window＝ 5s； （ 2）測試樣品的提取離子流其信噪比 ≥3（ S/N≥3）； （ 3）在同一測定批次中，測試樣品的提取離子流應(yīng)當(dāng)與外標(biāo)相應(yīng)的提取離子流相似，其定量離子對和非定量離子對的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定量離子對和非定量離子對的豐度比數(shù)值偏差 ≤25％。AHD:。本文選用 LiChrolut EN萃取柱做為凈化柱。另外，禽肉中硝基呋喃的代謝物以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中，只有在適當(dāng)酸性條件下，通過水解才能釋放出來。g/㎏； C—— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃 度， ng/mL； Csi —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中 內(nèi)標(biāo)物 的濃度， ng/mL； Ci —— 樣液中 內(nèi)標(biāo)物 的濃度， ng/mL； As —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積； A —— 樣液中 待測目標(biāo)物 的峰面積； Asi —— 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積 ； Ai —— 樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積； V —— 樣品定容體積， mL； W—— 樣品稱樣量， g； 注：計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。g/kg目標(biāo)化合物。 水解 于離 心殘留物中加 50181。 氯化鈉于 1000mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度 液 態(tài)混合凈化試劑 移取 5mL 正己烷與 5mL 容量瓶中混勻 甲酸溶液（ %）