【正文】 林和呋喃妥因的代謝物。在添加濃度 ~2μg/kg范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法回收率為%~%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD）小于 %。呋喃西林難溶于水 (1:4200)，微溶于乙醇 (1:590)，呋喃唑酮幾乎不溶于水和乙醇；呋 喃妥因幾乎不溶于水，微溶于乙醇。呋喃唑酮用于防治水生動(dòng)物疾病，如用 1μg/kg~2μg/kg防治觀賞魚蛀鰭爛尾病和羅非魚潰爛病。 硝基呋喃類藥物的危害及其管理對(duì)策 硝基呋喃類藥物的主要危害 （ 1）對(duì)畜禽有毒性作用。 （ 2）具有致癌致畸致突變。 （ 3）代謝產(chǎn)物對(duì)人體危害嚴(yán)重。這些代謝物可以在弱酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)，因此，當(dāng)人類吃了含有硝基呋喃類抗生素殘留的食品，這些代謝物就可以在人類胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)被人體吸收而對(duì)人類健康造成危害。 1990 年 7 月 歐盟頒布 2377/90/EEC 條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物列為 A 類禁用藥物，規(guī)定其在動(dòng)物源性食品中的殘留檢測(cè)限為[3]。 我國(guó)農(nóng)業(yè)部文 件農(nóng)牧發(fā) [2021]號(hào)也規(guī)定動(dòng)物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。 2021 年 4 月，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第 193號(hào)公告 (食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單 )將硝基呋喃類藥物列為禁止使用的藥物。 （ 1）加強(qiáng)培訓(xùn)與宣傳，提高安全用藥意識(shí)。 （ 3）加強(qiáng)飼料生產(chǎn)管理。養(yǎng)殖過程是獸藥殘留監(jiān)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，養(yǎng)殖者是動(dòng)物源性食品安全的主體，其安全用藥與否直接關(guān)系到食品安全。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的樣品處理方法 樣品的處理通常包括均質(zhì)、提取、凈化、衍生化等步驟，以達(dá)到釋放殘留物特別是蛋白結(jié) 合殘留物、去除干擾基質(zhì)、濃縮目標(biāo)分析物的目的。粉碎后的樣品，用水、氯化鈉溶液或鹽酸溶液混合均相；奶類和蜂蜜等樣品的處理，可直接用水或鹽酸溶液混合均勻。除此之外，三氯乙酸、甲醇 /乙醇 /二乙醚、 Mcllvaine 緩沖溶液 /甲醇、偏磷酸 /甲醇、檸檬酸 /磷酸氫二鈉、氯仿 /乙酸乙脂 /二甲基亞砜都有應(yīng)用的報(bào)道。 2NBA 是采用最多的衍生化試劑，該類衍生物在色譜柱上有較好的保留，在質(zhì)譜儀上有特征的離子碎 片，靈敏度高。通過采用 2NBA進(jìn)行衍生化，使得上述代謝物的衍生物 NPSEM、 NPAOZ、 NPAHD、 NPAMOZ相對(duì)分子質(zhì)量分別達(dá)到 、 、 、 ，在適當(dāng)?shù)呐鲎搽妷合戮a(chǎn)生不少于兩個(gè)特性離子的碎片峰， MS 檢測(cè)靈敏度提高，更適合于質(zhì)譜的定性和定量。常用的凈化技術(shù)包括傳統(tǒng)的液液萃?。?LLP） 、固相萃取 （ SPE） 、基體固相分散技術(shù) （ MSPD） 、在線透析和微量富集技術(shù)。為了達(dá)到更好的凈化效果，正己烷常被用于對(duì)樣品萃取液的進(jìn)一步脫脂。 固相萃取技術(shù) （ SPE） 固相萃取技術(shù)是一種色譜凈化技術(shù)。 SPE 柱有多種，如 Phenomenex SDBL 反相聚合的苯乙烯 二乙烯基苯柱，基于共聚物憎水性和 ππ共軛鍵的相互作用，該柱對(duì)硝基呋喃有很強(qiáng)的選擇性保留，而大多數(shù)基質(zhì)干擾物保留較弱，能保留、洗脫硝基呋喃的 4 種待測(cè)物，效果很好。 SPE 的特點(diǎn)包括穩(wěn)定可靠，有更好的重現(xiàn)性和高的回收率，不會(huì)產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，可消除乳化，減少溶劑的使用，可用于大范圍內(nèi)的不同基質(zhì)。方法用雙相透析膜將待測(cè)物在線分離，然后用液相色譜柱（ Bondapak C18/Corasil， 37~50μm，或者 XAD4， 50~100μm）將 4種硝基呋喃預(yù)富集，先將共萃取的基質(zhì)淋洗至廢液中，再將濃縮的分析物沖到第一章 引 言 8 分析柱上分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，可達(dá)到 1~5μg/kg的檢出限?，F(xiàn)在各研究機(jī)構(gòu)已開始關(guān)注其代謝物的檢出，國(guó)內(nèi)外報(bào)道過用于檢測(cè)硝基呋喃類抗生素及其代謝物殘留的方法主要有色譜分析方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。通常用高效液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)器測(cè)定硝基呋喃類藥物代謝物時(shí)，因?yàn)檫秽Y(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導(dǎo)致靈敏度過低，不能滿足出口產(chǎn)品檢測(cè)硝基呋喃類代謝產(chǎn)物殘留限量的要求 [11]。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟組織和魚肉中呋喃唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟、魚肉組織中的檢測(cè)限分別為 50、 50、 25μg/kg，回收率分別為80%~110%、 60%~130%、 50%~140%、 70%~120%。由此可見，高效液相色譜 (紫外檢測(cè)器 )檢測(cè)硝基呋喃類抗生素的方法已逐漸趨于成熟，靈敏度不斷提高，檢測(cè)限能滿足國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)品中微量呋喃唑酮測(cè)定的要求。樣品經(jīng)提取凈化后，以(28∶ 72)和 %的冰醋酸為流動(dòng)相，在 NovaPakC18柱上分離， CoulochemⅡ 檢測(cè)器檢測(cè) (工作電極為多孔石墨電極，工作電位600mV)。在 25ng/ml的添加回收率分別為 (85177。6)%、 (83177。其回收率在 %~%。近些年來(lái)，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù) (LCMS)測(cè)定硝基呋喃類代謝物在動(dòng)物組織中的殘留越來(lái)越多被采用，與用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)方法比較，質(zhì)譜檢測(cè)器技術(shù)具有定性、定量準(zhǔn)確，抗干擾能力強(qiáng)，檢測(cè)限低，測(cè)定快速等特點(diǎn) [17]。近幾年國(guó)內(nèi)外采用 HPLCMS對(duì)各種藥物及其代謝物的研究取得了一定的進(jìn)展。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用 HPLCMS方法檢測(cè)限分別為 、 、 。肝臟和肌肉組織的檢測(cè)限為 10ng/g，回收率大于 80%。 由此可見 LCMS是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)、快速的分析確證硝基呋喃類藥物殘留的方法。顯然，并非所有的殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都具備 HPLCMS/MS儀器條件 [45]。四種硝基呋喃類抗生素代謝物 AOZ、 AMOZ、 SC、 AH的檢測(cè)限分別是 、 、 、 ，定量限分別是 、 、 、 ，測(cè)定響應(yīng)值的線性范圍從檢測(cè)限到 800ng/g之間。定量限 AMOZ、 AOZ均為， SC、 AH均為 ；檢測(cè)限 AMOZ、 AOZ均為 ， SC、 AH均為。目前，我國(guó)已將液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 (LCMS/MS)作為測(cè)定蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法(GB/)，從 2021年 8月 1日開始實(shí)施。 BautistaOrdonezJA等 [28]利用分光光度法測(cè)定出售的雞飼料中的呋喃西林和呋喃唑酮的濃度，并檢測(cè)到飼料中有呋喃西林和呋喃唑酮的存在。羅杰、李健 [29]建立了呋喃唑酮間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)法，將呋喃唑酮與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白 (HAS)聯(lián)接，分別作為免疫原及包被原，建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物組織中呋喃唑酮的 ELISA篩選方法，測(cè)定的最適范圍為 10~100ng/ml，最小檢測(cè)限為 1ng/ml。所涉及的設(shè)備有組織搗碎機(jī)、微孔板酶標(biāo)儀 (450nm)、離心機(jī)、振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、磁力攪拌器、微量加樣器、多道移液器、混合器 (旋轉(zhuǎn)后超聲 )等。在 450nm處 測(cè)量 (選擇參比波長(zhǎng) 600nm)，吸光度與樣品中的 AOZ濃度成反比。得到平均回收率和變異系數(shù) RSD；③ 方法重現(xiàn)性。 在所有恒溫孵育過程中，應(yīng)避免光線照射，用試劑盒中提供的蓋板蓋住微孔板。 2021年， Kevin [30]首先制備出了呋喃唑酮代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)的衍生物的高特異性多克隆抗體，IC50值為 ，其高靈敏度能夠滿足當(dāng)前獸藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)，為呋喃唑酮代謝物的免疫分析方法奠定了基礎(chǔ)。方法同 LCMS/MS方法的相關(guān)性很好， r。各種聯(lián)用技術(shù)如 LCMS、 LCMS/MS提高了分析的靈敏度、精確度，降低了檢測(cè)限，假陽(yáng)性率更低，特異性更強(qiáng)，在藥物殘留分析中應(yīng)用發(fā)展迅速且前景廣闊，但同時(shí)也存在同 HPLC方法一樣的缺點(diǎn)。高效液相色譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)是硝基呋喃類抗生素及其代謝物的最終確證性的檢測(cè)方法。根據(jù)歐盟 2021/621/EC決議，輸歐的蜂蜜和蜂王漿、養(yǎng)殖水產(chǎn)品、剝殼和 /或加工蝦、小龍蝦、腸衣、兔肉必須出具相應(yīng)的化學(xué)殘留檢測(cè)證明。而且國(guó)外也已經(jīng)開發(fā)出呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒。因此 ， 研制準(zhǔn)確、靈敏、特異性高、方便高效穩(wěn)定的檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物的試劑盒是今后國(guó)內(nèi)檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物殘留方法的目標(biāo)和方向 ， 值得我們深入研究和開發(fā)。 儀器和設(shè)備 實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器及設(shè)備 如下 ： 表 21 主要儀器和設(shè)備及其型號(hào)或容量 儀器及設(shè)備名稱 型號(hào)或容量 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜儀 Agilent1100， API4000，配有電噴霧離子源 離心機(jī) Eppendorf 5810R 高速組織搗碎機(jī) IKA T25 氮?dú)鉂饪s裝置 PIERCE MODEL 1878 快速混勻器 IKA MS2 固相萃取真空裝置 SUPELCO 公司 Eppendorf 移液器 ， ， 均質(zhì)器 UltraTurrax 恒溫振蕩裝置 MEMMER 分析天平 Shimadzu SEU210 一次性注射式濾器 配有 微孔濾膜 聚四氟乙烯離心管 50mL 棕色雞心瓶 100mL Agilent HPLC 微量進(jìn)樣瓶 pH 計(jì) 上?？祪x PHS3C 型，測(cè)量精度 177。L 至 50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（ 100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 100181。 分析步驟 洗樣 稱取 177。L混合內(nèi)標(biāo)工作液，再 加入 及 （ ）， 8000r/min勻漿約 2min。 （ 2）乙酸乙酯提取及 EN SPE 柱凈化（適用于高度渾濁濾液，如蝦、肝、蚌等樣品） 將 過濾后上清液加入到 LiChrolut EN 柱中，（預(yù)先用 3mL 乙酸乙酯、 3mL甲醇和 5mL 水進(jìn)行活化），用 3mL 水洗滌，壓干，直至其吸附劑的顏色由棕色變?yōu)槌壬?3mL 乙酸乙酯洗脫分析物，洗脫液經(jīng)氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)?1mL 流動(dòng)相溶解，過 ，供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。按照上述分析條件繪制目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線。 定量方法 以 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比為縱坐標(biāo)，工作溶液濃度（ μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。 總離子流圖和保留時(shí)間 在上述方法中色譜條件和質(zhì)譜條件下，目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見圖31，其參考保留時(shí)間見表 31。AOZ:) 表 31 硝基呋喃代謝物及內(nèi)標(biāo)參考保留時(shí)間 藥物名稱 保留時(shí)間 /min AMOZ AMOZD5 SEM SCA13C15N2 AHD AHD13C3 AOZ AOZD4 樣品衍生條件的優(yōu)化 四種硝基呋喃代謝物的分子量在 102~201之間，在這個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜背景噪音很大，四種代謝物的電離效率又比較低。因此，本方法采用鹽酸水解硝基呋喃代謝物與蛋白結(jié)合物，用 2NBA衍生四種代謝物，二第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 26 個(gè)步驟同步進(jìn)行，見圖 32 圖 32 結(jié)合態(tài)硝基呋喃代謝物的同步水解和衍生化 凈化條件的選擇 本文實(shí)驗(yàn)了兩種樣品凈化 方式，一是衍生化反應(yīng)溶液，調(diào) pH后用乙酸乙酯提取兩次，合并乙酸乙酯層氮?dú)獯蹈啥ㄈ荨? 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用 ESI正離子電離模式，通過掃描確定 4種組分的母離子 MS2及確定子離子，再采用自動(dòng)和手動(dòng)優(yōu)化相結(jié)合的方式對(duì)每種硝基呋喃類代謝物及內(nèi)標(biāo)物子離子進(jìn)行 CE、 DP、 EP、 CXP的化合物條件及 IE、 CUR、 NEB、 TEM、 GAS2等離子源條件的優(yōu)化，兼顧各成分的靈敏度的不同而對(duì)離子源條件有所偏重，建立了質(zhì)譜條件，見表 32，和 4種硝基呋喃代謝物及各自內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的監(jiān)測(cè)離子圖譜，見圖 33， 34， 35， 36。另外是采用固相萃取柱凈化，實(shí)驗(yàn)了 Oasis Max(60mg,3ml Waters) ， Oasis HLB(60mg,3ml Waters) ，C18(500mg,3ml,)和 LiChrolut EN(200mg,3ml,Merck)四種固相萃取柱的凈化效果和回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， LiChrolut EN柱凈化效果和回收率比另外三種固相萃取柱 都較理想。用 2硝基苯甲醛 (2NBA)衍生四種代謝物，可以分別形成具有較好特性的衍生物，質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度有很大提高。SEM:。 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 24 第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 結(jié)果計(jì)算 內(nèi)標(biāo)法定量，按 下 式 計(jì)算： 10001000i s is i i sC C A A VX C A A W? ? ? ???? ? ? 式中： X —— 試樣中待測(cè)組分殘留量， 181。測(cè)試樣品按以下順序進(jìn)樣：試劑空白、陰性控制樣（樣品空白）、第二章 實(shí)驗(yàn)方法 23 要確證的樣品、陰性控制樣品（樣品空白）再進(jìn)樣，最后是陽(yáng)性控制樣品（質(zhì)控樣品或添加 回收樣品）。L； （ 2）質(zhì)譜條件 a) 離子源：電噴霧離子源； b) 掃描方式：正離子掃描； c) 檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)； d) 電噴霧電壓： 5500V； e) 霧化氣壓力： ； f) 氣簾氣壓力： ； g) 輔助氣壓力： ； h) 離子源溫度： 500℃ ； 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定 制備濃度系列分別為 、 、 18ng/mL的硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別相當(dāng)于測(cè)試樣品含有 、