【正文】 本文選用 LiChrolut EN萃取柱做為凈化柱。另外，禽肉中硝基呋喃的代謝物以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機體組織中，只有在適當酸性條件下，通過水解才能釋放出來。AHD:。g/㎏； C—— 標準工作溶液的濃 度， ng/mL； Csi —— 標準工作溶液中 內(nèi)標物 的濃度， ng/mL； Ci —— 樣液中 內(nèi)標物 的濃度， ng/mL； As —— 標準工作溶液的峰面積； A —— 樣液中 待測目標物 的峰面積； Asi —— 標準工作溶液中內(nèi)標物的峰面積 ； Ai —— 樣液中內(nèi)標物的峰面積； V —— 樣品定容體積， mL； W—— 樣品稱樣量， g； 注：計算結(jié)果應扣除空白值。 定性方法 （ 1） 在同一天同一批次測試中，其定性離子對的提取離子流的保留時間與標準溶液或添加回收樣品的相應離子對提取離子流的保留時間之差在 （ RT Window＝ 30s），其中 AHD RT Window＝ 5s； （ 2）測試樣品的提取離子流其信噪比 ≥3（ S/N≥3）； （ 3）在同一測定批次中，測試樣品的提取離子流應當與外標相應的提取離子流相似，其定量離子對和非定量離子對的豐度比與標準物質(zhì)的定量離子對和非定量離子對的豐度比數(shù)值偏差 ≤25％。g/kg目標化合物。 提取和凈化 （ 1）乙酸乙酯提取 將過濾后上清液轉(zhuǎn)移至 250mL 分液漏斗中，加入 20mL 乙酸乙脂振蕩提取，靜置分層，收集上層乙酸乙酯溶液，重復操作兩次 ，合并兩次乙酸乙酯提取液，加入 15mL30%NaCl 溶液振蕩，靜置分層，棄去下層 NaCl 溶液，重復操作兩次，合并乙酸乙脂提取液于棕色雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮氣流吹干，精密加入 %甲酸溶液和 液態(tài)混合凈化試劑渦旋混勻 ，轉(zhuǎn)移至 15mL離心管中， 6000r/min 離心 5min，棄去下層液，再加入 液態(tài)混合凈化試劑重復操作，取上層溶液過 ，供液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定。 水解 于離 心殘留物中加 50181。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻 實驗方法 試樣制備與保存 從所取原始樣品中取出部分有代表性樣品，經(jīng)高速組織搗碎機搗碎，用四分法縮分出不少于 500g 試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后作出標記，樣品于 20℃保存。 氯化鈉于 1000mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度 液 態(tài)混合凈化試劑 移取 5mL 正己烷與 5mL 容量瓶中混勻 甲酸溶液（ %） 移取甲酸 1mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻 甲酸溶液（ %） 移取甲酸 2mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻 甲醇 水（ 50+50）溶液 甲醇與水等量混合，搖勻 標準物質(zhì)和標準溶液 （ 1） 實驗所用到的標準物質(zhì)如下： 表 24 標準物質(zhì)的純度及其生產(chǎn)廠家 名稱 純度 生產(chǎn)廠家 AMOZ %～ ％ SigmaAldrich 公司 SEM %～ ％ SigmaAldrich 公司 AOZ %～ ％ SigmaAldrich 公司 AHD %～ ％ SigmaAldrich 公司 AMOZD5 ％～ % Witega 公司 SCA13C15N2 ％～ % Witega 公司 AOZD4 ％～ % Witega 公司 AHD13C3 ％～ % Witega 公司 第二章 實驗方法 20 （ 2）實驗所用到的標準溶液配制如下： 表 25 標準溶液及其配制方法 溶液名稱及濃度 配制方法 標準貯備液（ 1mg/mL） 分別精確稱取 50mgAOZ、 AMOZ、 SEM、AHD 至 50mL 容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻 混合標準中間液（ 10μg/mL） 移取 AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD 的標準儲備液各 500181。液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定，內(nèi)標法定量。如果能研制出檢測硝基呋喃類藥物代謝物的試劑盒 ， 使其與同類進口試劑盒相比在靈敏度、準確性、穩(wěn)定性、回收率方面接近或者優(yōu)于進口試劑盒 ， 則能彌補國內(nèi)空白。 國外對硝基呋喃類藥物及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù) ， 而且趨于成熟 ， 其檢測限能滿足歐盟的 1μg/kg的最低檢測限量的要求。 近幾年歐盟、美國、日本等發(fā)達國家對從我國進口的動物源性食品都要求嚴格檢測硝基呋喃類藥物及其代謝物。從選擇性、準確性、靈敏性、穩(wěn)定性、操作難易及費用等方面綜合考慮，酶聯(lián)免疫分析法 (ELISA)是比較好的殘留檢測方法，但不能作為確證方法。高效液相色譜 (HPLC)方法的優(yōu)點是自動化、精確度高、假陽性率低，缺點是儀器昂貴、操作繁瑣、樣品第一章 引 言 15 處理復雜、成本高、廢棄試劑易造成環(huán)境污染、需要專業(yè)分析人員。 IvaDiblikova等 [31]又制備出呋喃唑酮代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)的衍生物的高特異性單克隆抗體并建立了直接競爭 ELISA方法，其 CCβ值為 ，與已建立的確證性的 LCMS/MS方法的 。 由于硝基呋喃類抗生素代謝迅速，目前國外報道的免疫分析方法都是針對硝基呋喃類抗生素代謝物的 ELISA方法。另外幾種硝基呋喃類藥物呋喃他酮 (AMOZ)、呋喃妥因 (AHD)和硝基呋喃腙 (SEM)的藥代動力學與呋喃唑酮相似，共同的亞糠基主鏈代謝很快，而相應的側(cè)鏈 AMOZ、 AHD和 SEM第一章 引 言 14 結(jié)構(gòu)差異較大，其 2NBA衍生物與 NPAOZ相比，其 IC50均大于 ，即以NPAOZ為基準抗原，它們的交叉反應率均低于 %，表明此 NPAOZ的蛋白抗體特異性良好 [30]。添加實驗是在陰性樣品中加入 AOZ標準溶液后按樣品前處理和樣品分析進行平行實驗。加入反應終止液后使顏色由藍轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。競爭性酶聯(lián)免疫法 (ELISA)測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應 (雙抗體反應 )?，F(xiàn)有的文獻報道的方法也只有酶聯(lián)免疫分析法（ ELISA方法， ELISA方法的優(yōu)點是靈敏度高、操作簡便、檢測迅速；缺點是仍不能實現(xiàn)在線檢測，而且假陽性率較高。此方法測定簡便，線性相關(guān)系數(shù) r，試樣回收率在 95%~102%之間。方法的檢出限為 ~，線性范圍均 102，線性方程的相關(guān)系數(shù) r，回收率為 %~%。彭濤等 [11]利用 LCMS/MS方法同時測定動物肌肉組織中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西 林和呋喃妥因的代謝物。被分析物被酸性水解從組織中釋放，用 2硝基苯甲醛衍生化，利用固相萃取 (SPE)將樣品凈化。歐盟 EEC/657/2021指令規(guī)定對于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達到四個確證點 (一個質(zhì)譜離子為一個確證點 )。徐維海等采取 LCMS法研究呋喃唑酮及其主要代謝產(chǎn)物 AOZ在羅非魚體內(nèi)的殘留規(guī)律，利用該方法對呋喃唑酮及其代謝物 AOZ的檢出限分別為 1μg/kg[22]。Robert Kennedy[20]利用 LCMS方法測定豬組織中呋喃唑酮的代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)，組織樣品先用甲醇 水反復溶解洗滌并用2硝基苯甲醛衍生化后分析測定。 Rosa Draisci等 [32]利用 HPLCDAD(光二極管陣列檢測器 )檢測雞蛋中硝基呋喃類藥物殘留并用 HPLCMS進行確認。目前 HPLCMS連用技術(shù)已 經(jīng)成為制藥業(yè)、藥物分析與研制等領(lǐng)域十分重要的分析方法，在環(huán)境分析中也起著重要作用，同時也是生物化學和生物技術(shù)大量使用的工具。將色譜和質(zhì)譜技術(shù)進行聯(lián)用，對混合物中微量或痕量組分的定性和定量分析具有重要 意義 [18]。 AlawiMA[17]利用改進的 HPLC/ELCD高效液相色譜電化學檢測器檢測雞組織和雞蛋中的呋喃唑酮和鹽酸呋喃它酮。1)%~(97177。相對標準偏差 (n=11)分別為 %、 %、 %(Height)和 %、 %、 %(Area)，檢測限分別為 4ng/ml(Height)和 4ng/ml(Area)。 [16]利用 HPLCECD(庫侖法 )來檢測牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮。于慧娟等 [14]利用高效液相色譜法 (配有紫外檢測器 )測定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，其方法靈敏度高，檢測限為 。我國農(nóng)業(yè)部于 2021年 11月 1第一章 引 言 9 日發(fā)布農(nóng)牧發(fā) [2021]38號文件，發(fā)布了 10種動物源食品中獸藥殘留檢測方法，其中呋喃唑酮的檢測方法就是高效液相色譜法 (紫外檢測器 )。 高效液相色譜法 (HPLC) （ 1） 液相色譜 紫外檢測器 (LCUV) 在硝基呋喃類抗生素原藥化合物的檢測中高效液相色譜應用最多，而高效液相色譜最常用的檢測器就是紫外檢測器 (UV，包括二極管陣列檢測器 DAD)。其他 硝基呋喃類抗生素也有類似特性。 在線透析和微量富集技術(shù) [9]等報道在線透析和微量富集技術(shù)應用于動物源性食品肉類、奶類和蛋類中硝基呋喃的分析。凈化過程包括柱子活化、淋洗和洗脫。有學者報道用非極性吸附劑如反相 C18或者 XAD2 可獲得高的回收率，然而在許多情況下，非極性吸附劑在從萃取物中除去干擾物的凈化過程并不理想，一些極性吸附劑例如硅膠、氧化鋁或者氨丙基材料也常常被采用，以達到更好的萃取凈化效果。 [6]等和 [7]等報道了硅藻土的應用，[8]等利用非極性的 C18衍生硅膠等作為吸附劑，成功地凈化了奶中的呋喃唑酮。實驗證明，在酸性條件下，乙酸乙脂、二氯甲烷對溶液中的硝基呋喃殘留物萃取效果好，也有加入氯化鈉以進一步提高二氯甲烷萃取效率的報道。樣品凈化的目的就是為了減少萃取中的共萃取基質(zhì)，濃縮目標分析物。 SEM、 AOZ、 AHD 和 AMOZ 的相對分子質(zhì)量分別為 、 、 、第一章 引 言 6 ，在此質(zhì)量范圍內(nèi)， MS 噪音大，加上分析物較低的離子化效率和無特征的碎片行為， MS 檢測靈敏度很低，給定量特別是定性帶來困難 。對衍生化試劑的選擇，許多研究者對此進行了大量的探索，芳香醛類如 2硝基苯甲醛 （ 2NBA） 、吡啶 3羰基甲醛、 2， 4二硝基苯甲醛、 2羥基 5硝基苯甲醛和 2氯苯甲醛，均能與硝基呋喃游離代謝產(chǎn)物的自由氨基團反應，形成具有較好特性的芳香亞胺類衍生物。常用的有機溶劑包括乙腈、乙酸乙脂、二氯甲烷等。盡量避免將整個樣品一次第一章 引 言 5 均相，引起酶的活性增加，從而造成分析物的損失。加大投入，盡快建設(shè)完善我國動物源性食品的獸藥殘留監(jiān)控體系，形成國家、省、市、縣完整的獸藥殘留檢測網(wǎng)絡(luò)梯級結(jié)構(gòu)；加快我國獸藥殘留監(jiān)控檢測方法的研究步伐，發(fā)展簡單快速準確靈敏的分析技術(shù)；加強對生產(chǎn)、加工和流通環(huán)節(jié)的監(jiān)管，加大對養(yǎng)殖場、加工廠和農(nóng)貿(mào)市場等畜禽及產(chǎn)品的抽樣檢測力度。 （ 4）加強畜禽養(yǎng)殖的管理。嚴格按照獸藥管理條例、獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范 GMP和獸藥經(jīng)營管理規(guī)范 GSP的要求規(guī)范生產(chǎn)經(jīng)營行為，加大對 生產(chǎn)、經(jīng)營企業(yè)的監(jiān)督管理，嚴厲查處生產(chǎn)、經(jīng)營禁用藥的行為。但是硝基呋喃類藥物殘留超標事件時有發(fā)生，嚴重危及動物源性食品安全和出口，因此，必須進一步強化對硝基呋喃類藥物的管理。歐盟 EEC2377/90規(guī)定動物源性食品中不得檢出硝基呋喃 (包括呋喃唑酮 )。 2021 年美國 FDA 公布了禁止在進口動物源性食品中使用的 11 種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。歐盟 (EU)從 1997 年開始將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物。普通的食品加工方法 (如燒烤、微波加工、烹調(diào)等 )難以使蛋白結(jié)合態(tài)呋喃唑酮殘留物大量降解。硝基呋喃類化合物是直接致變劑，它不用附加外源性激活系統(tǒng)就可以引起細菌的突變。獸醫(yī)臨床上經(jīng)常出現(xiàn)有關(guān)豬、鴨、羊、鴿子等呋喃唑酮中毒的事件報道。呋喃妥因內(nèi)服吸收較快，體內(nèi)消除快，此藥由尿的排出量大，故主要用于治療尿道感染；而呋喃西林在本類藥物中毒性最大，主要用作局部或創(chuàng)傷的感染的外用消毒劑。其中呋喃唑酮內(nèi)服后難吸收，腸中濃度高而血中濃度低，故適用于各種腸道感染的治療，呋喃唑酮可用于治療小兒菌痢、傷寒、消化性潰瘍等疾病，呋喃唑酮的復方緩釋制劑是衛(wèi)生部批準的抗 HP(HP是胃潰瘍的主要致病 菌 )感染的藥物。硝基呋喃類抗生素主要包括呋喃唑酮 (Furazolidone)、呋喃它酮 (Furaltadone)、呋喃西林 (Nitrofurazone)、呋喃妥因 (Nitrofurantoin)等，見圖 11，呋喃類物質(zhì)均為性質(zhì)穩(wěn)定的黃色粉末，無味或味微苦。后用乙酸乙酯提取，正己烷凈化，分析物采用電噴霧電離正離子（ ESI+）、多反應檢測（ MRM）模式檢測，內(nèi)標法定量。 山東理工大學 畢業(yè) 論文 題 目： 動物組織中硝基 呋喃 代謝物殘 留量 的測定方法 學 院： 專 業(yè)： 食品科學與工程 學生姓名 ： 指導教師 ： 畢業(yè)論文 時間：二ОО 八 年 二 月 二十五 日～ 六 月 二十 日 共 十七 周 摘 要 I 摘 要 用高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜（ LCMS/MS）法同時測定動物組織及水產(chǎn)品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西