【正文】 ............................. 17 目 錄 IV 儀器和設(shè)備 .................................................................................................... 17 試劑與溶液 .................................................................................................... 18 主要試劑 ............................................................................... 18 主要溶液的配制 .................................................................... 18 標準物質(zhì)和標準溶液 ............................................................. 19 實驗方法 ........................................................................................................ 20 試樣制備與保存 .................................................................... 20 分析步驟 ............................................................................... 20 洗樣 ................................................................................. 20 水解 ................................................................................. 20 提取和凈化 ...................................................................... 20 儀器參數(shù)與設(shè)定 ............................................................... 21 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定 ................................................... 22 定性方法 ........................................................................... 22 定量方法 ........................................................................... 23 第 三章 結(jié)果計算及討論 ........................................................................ 24 結(jié)果計算 ........................................................................................................ 24 總離子流圖和保留時間 ................................................................................ 24 樣品衍生條件的優(yōu)化 .................................................................................... 25 凈化條件的選擇 ............................................................................................ 26 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 ............................................................................................. 26 檢測限、測定低限、回收率和精密度 ......................................................... 29 回收率統(tǒng)計 ........................................................................... 29 重復性統(tǒng)計 ........................................................................... 33 內(nèi)標法定量 .................................................................................................... 38 標準曲線圖譜及線性范圍 ............................................................................ 39 標準曲線圖譜 ........................................................................ 39 線性范圍 ............................................................................... 41 質(zhì)量控制及注意事項 .................................................................................... 41 目 錄 V 質(zhì)量控制 ............................................................................... 41 注意事項 ............................................................................... 42 結(jié)論 ..................................................................................................... 44 參考文獻 .............................................................................................. 45 致謝及聲明 ........................................................................................... 48 第一章 引 言 1 第一章 引 言 硝基呋喃類藥物的性質(zhì)和使用 硝基呋喃類藥物 (Nitrofurans)是人工合成的具有 5硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，對 大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲均有作用，在低濃度下對上述病原體有抑制作用，高濃度則有殺滅作用，其抗菌作用機理是干擾細菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，使細菌代謝紊亂 [1]。呋喃唑酮用于防治畜禽腸道感染，如兔球蟲病、豬痢疾、禽白痢、火雞黑頭病等 [2]。通過對小白鼠和大白鼠的毒性研究表明，呋喃 唑酮可以誘發(fā)乳腺癌和支氣管癌，并且有劑量反應關(guān)系；高劑量飼喂食用魚和觀賞魚，可誘導魚的肝臟發(fā)生腫瘤；繁殖毒性結(jié)果表明，呋喃唑酮能減少精子的數(shù)量和胚胎的成活率。 硝基呋喃類藥物的管理對策 由于硝基呋喃類藥物殘留危害嚴重，美國、日本和歐盟等國家和地區(qū)紛紛采取措施，嚴加監(jiān)管。韓國 2021 年版《食品公典》規(guī)定豬肉中不得檢出呋喃唑酮。 （ 2）加強獸藥生產(chǎn)經(jīng)營管理。 （ 5）加強獸藥殘留監(jiān)控。在樣品的提取和去蛋白過程中，有機溶劑也能從內(nèi)源性大分子中萃取非共價鍵結(jié)合的殘留物。 同樣地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白結(jié)合代謝物，經(jīng)酸水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 SEM、 AMOZ 和 AHD。 液液萃取 （ LLP） 液液萃取是最經(jīng)典、常用的凈化手段，可以用有機溶劑將待測物從溶液中萃取出來，或者將干擾物質(zhì)從有機相或水相萃取物中除 去。用固相萃取柱可以從共萃取物中凈化和濃縮硝基呋喃萃取物。此外，高通量的 96 孔板，可滿足處理大量樣品的要求。近年來各種色譜聯(lián)用技術(shù)分析法在硝基呋喃類抗生素的代謝物的檢測中應用較多，發(fā)展迅速，主要是與質(zhì)譜聯(lián)用（包括串聯(lián)質(zhì)譜）。 葛寶坤等 [13]采用固相萃取 (SPE)前處理凈化技術(shù)，高效液相色譜 (配有紫外檢測器 )法快速測定雞肉、魚、蝦中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量， 4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚、蝦樣品中 3個不同水平的添加回收率 (n=7)為 87%~102%；相對標準偏差 (RSD)為 %~%；工作曲線的線性范圍為 5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為 2μg/kg。其中呋喃唑酮、呋喃它 酮、呋喃妥因測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù) r分別為 、 、 (Height)和、 、 (Area)。9)%。 LCMS法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，可以排除酶聯(lián)免疫方法和 HPLC法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。在溶解提取物用鋁土柱凈化后，用 HPLCUV篩選可能含有呋喃唑酮的樣品， LCMS方法用來確定證實陽性樣品。 （ 2） 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 (LCMS/MS) 最近幾年用于檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的 LCMS/MS方法發(fā)展迅速，它是一種靈敏度更高 、選擇性更好、特異性更強的一種方法，歐盟目前認為HPLCMS只能用于對硝基呋喃代謝產(chǎn)物進行篩選實驗，對檢出的陽性結(jié)果必須再用 LCMS/MS進行確證。 Pascal Mottier等 [25]利用 LCMS/MS方法，電噴霧電離 (ESI)，內(nèi)標法定量檢測肉中 4種硝基呋喃類抗生素的代謝物，方法的判定限 CCα值為~，檢測能力 CCβ值為 ~，低于歐盟規(guī)定的 1μg/kg的最低檢測限量的要求。廖峰等 [27]利用分光光度法測 定飼料中的呋喃唑酮，這種方法是將飼料試樣中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺 (DMF)提取出來，使其與苯肼鹽酸溶液反應，產(chǎn)生亮黃色的反應物，再用甲苯萃取后，在 440nm處用分光光度計讀取其吸光值，從而進行測定。)%，在試驗濃度范圍內(nèi)，呋喃唑酮的抗血清與呋喃西林的交叉反應性為 43%，與其他藥物未顯示免疫交叉反應性。根據(jù)試劑空白 A450值由校準曲線求出相應濃度，以其 3倍標準偏差和 10倍標準偏差乘以前處理稀釋倍數(shù) 2分別作為檢測限 (LOD)和定量檢測限(LOQ)，得到相應的試劑空白對應的濃度，標準偏差 SD；檢測限 (LOD)；定量檢測限 (LOQ)； ② 方法回收率和精密度。對沒有全自動酶標儀的實驗室而言，結(jié)果計算時也可用由試劑盒供應商提供的數(shù)據(jù)處理軟件經(jīng)電腦進行處理。 總結(jié) 從以上對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測方法進行的綜述中可以看出，國內(nèi)外對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù) ，另外還有免疫檢測方法和分光光度法等方法。發(fā)達國家對進口到他們國家的食品要求檢測的殘留藥物的數(shù)目越來越多，最高限量也越來越 低，我國出口的動物性食品退貨的現(xiàn)象越來越多而造成很大損失。但國內(nèi)還沒有關(guān)于硝基呋喃類藥物代謝物的免疫分析方法的報道 ， 目前國內(nèi)對試劑盒的使用還主要依靠從國外引進 ， 其價格昂貴。 10mL三角瓶中，加入 二甲亞砜，混勻 30%氯化鈉溶液 稱取氯化鈉 300177。 第二章 實驗方法 21 該步操作適用于測定結(jié)合態(tài)的硝基呋喃代謝物，如需測定代謝物總量，可省去該步驟。L； （ 2）質(zhì)譜條件 a) 離子源：電噴霧離子源； b) 掃描方式：正離子掃描； c) 檢測方式：多重反應監(jiān)測； d) 電噴霧電壓： 5500V； e) 霧化氣壓力： ； f) 氣簾氣壓力： ； g) 輔助氣壓力： ； h) 離子源溫度： 500℃ ； 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜測定 制備濃度系列分別為 、 、 18ng/mL的硝基呋喃代謝物混合標準溶液，分別相當于測試樣品含有 、 、 6181。 第三章 結(jié)果計算及討論 24 第三章 結(jié)果計算及討論 結(jié)