【正文】 、 6181。而后用 1mol/LNaOH或 HCl調(diào) pH至 ~，15℃ 4500r/min離心 15min，用 125mm濾紙過濾上清液。 第二章 實(shí)驗(yàn)方法 21 該步操作適用于測定結(jié)合態(tài)的硝基呋喃代謝物，如需測定代謝物總量，可省去該步驟。L 至 50mL容量瓶，甲醇定容，混勻 混合內(nèi)標(biāo)工作液（ 100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合內(nèi)標(biāo)中間液 100181。 10mL三角瓶中，加入 二甲亞砜，混勻 30%氯化鈉溶液 稱取氯化鈉 300177。水解產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用 %甲酸溶液溶解，較渾濁的樣品，如樣品蝦，可經(jīng)過乙酸乙酯提取，然后再經(jīng) SPE 凈化。但國內(nèi)還沒有關(guān)于硝基呋喃類藥物代謝物的免疫分析方法的報(bào)道 ， 目前國內(nèi)對試劑盒的使用還主要依靠從國外引進(jìn) ， 其價(jià)格昂貴。因此加快動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測方法的研究勢在必行。發(fā)達(dá)國家對進(jìn)口到他們國家的食品要求檢測的殘留藥物的數(shù)目越來越多，最高限量也越來越 低，我國出口的動物性食品退貨的現(xiàn)象越來越多而造成很大損失。分光光度法雖然操作簡單，但測定結(jié)果準(zhǔn) 確度不高，靈敏度低，不能作為確證性方法。 總結(jié) 從以上對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測方法進(jìn)行的綜述中可以看出，國內(nèi)外對硝基呋喃類抗生素及其代謝物的檢測大都利用色譜方法及其聯(lián)用技術(shù) ，另外還有免疫檢測方法和分光光度法等方法。通過分析 20個(gè)樣品，計(jì)算方法檢測限為 ，使用陰性蝦樣品添加濃度 ，批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 %和 %。對沒有全自動酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室而言，結(jié)果計(jì)算時(shí)也可用由試劑盒供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)處理軟件經(jīng)電腦進(jìn)行處理。不同的添加水平，得到相應(yīng)的平均回收率和變異系數(shù) RSD； ④ 交叉反應(yīng)。根據(jù)試劑空白 A450值由校準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)濃度，以其 3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差和 10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以前處理稀釋倍數(shù) 2分別作為檢測限 (LOD)和定量檢測限(LOQ)，得到相應(yīng)的試劑空白對應(yīng)的濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差 SD；檢測限 (LOD)；定量檢測限 (LOQ)； ② 方法回收率和精密度。其原理是：將被測樣本中的結(jié)合代謝殘留物經(jīng)水解、衍生形成 NPAOZ，其與過氧化物酶標(biāo)記的NPAOZ競爭結(jié)合有限的 NPAOZ抗體 (競爭性酶免疫分析 )，同時(shí)此抗體又與包被在微孔板條上針對它的抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的 NPAOZ后，加入酶反應(yīng)底物和生色劑到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。)%，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，呋喃唑酮的抗血清與呋喃西林的交叉反應(yīng)性為 43%，與其他藥物未顯示免疫交叉反應(yīng)性。 第一章 引 言 13 免疫分析法 （ IA） 國內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類抗生素的免疫分析方法的報(bào)道很少。廖峰等 [27]利用分光光度法測 定飼料中的呋喃唑酮，這種方法是將飼料試樣中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺 (DMF)提取出來，使其與苯肼鹽酸溶液反應(yīng)，產(chǎn)生亮黃色的反應(yīng)物，再用甲苯萃取后，在 440nm處用分光光度計(jì)讀取其吸光值，從而進(jìn)行測定。余建新等 [26]采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測方式建立了蜂蜜及水產(chǎn)品中 4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時(shí)測定的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)方法。 Pascal Mottier等 [25]利用 LCMS/MS方法，電噴霧電離 (ESI)，內(nèi)標(biāo)法定量檢測肉中 4種硝基呋喃類抗生素的代謝物，方法的判定限 CCα值為~，檢測能力 CCβ值為 ~，低于歐盟規(guī)定的 1μg/kg的最低檢測限量的要求。 Alexander Leitner等 [23]提出用 LCMS/MS方法同時(shí)分析動物肌肉組織中 四種硝基呋喃類抗生素的代謝物的方法。 （ 2） 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法 (LCMS/MS) 最近幾年用于檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的 LCMS/MS方法發(fā)展迅速，它是一種靈敏度更高 、選擇性更好、特異性更強(qiáng)的一種方法，歐盟目前認(rèn)為HPLCMS只能用于對硝基呋喃代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，對檢出的陽性結(jié)果必須再用 LCMS/MS進(jìn)行確證。目前， HPLC、LCMS相關(guān)聯(lián)的 NPAOZ提取方法 已經(jīng)得到改良，并通過一系列的加標(biāo)樣品研究得以驗(yàn)證。在溶解提取物用鋁土柱凈化后，用 HPLCUV篩選可能含有呋喃唑酮的樣品， LCMS方法用來確定證實(shí)陽性樣品。 HorneE等進(jìn)一步對該方法進(jìn)行改進(jìn)，利用 SPE簡化了衍生后的呋喃唑酮代謝物 NPAOZ的提取過程，再用 LCMS法進(jìn)行定性分析，對檢測豬肝中呋喃唑酮代謝物 AOZ的不同方法進(jìn)行比較研究，表明利用 HPLC法和 LCMS法測定 AOZ的結(jié)果基本相同 [20]。 LCMS法可以利用待測分子的結(jié)構(gòu)來定性，可以排除酶聯(lián)免疫方法和 HPLC法檢測的假陽性結(jié)果，用以確證檢測結(jié)果。 聯(lián)用技術(shù)分析法 （ 1） 液相色譜 質(zhì)譜法 (LCMS) 色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機(jī)化合物的定量分析，但定性較困難；質(zhì)譜儀只能夠?qū)我唤M分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，但對復(fù)雜化合物分析無能為力。9)%。9)%、第一章 引 言 10 (87177。其中呋喃唑酮、呋喃它 酮、呋喃妥因測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù) r分別為 、 、 (Height)和、 、 (Area)。 Owen Leon [15]利用 LCECD(工作電極為玻碳電極，工作電位 ，參比電極為 Ag/AgCl電極 )檢測用含有呋喃唑酮的飼料喂養(yǎng)的雞的肝臟和胸部肌肉組織中的呋喃唑酮的殘留。 葛寶坤等 [13]采用固相萃取 (SPE)前處理凈化技術(shù)，高效液相色譜 (配有紫外檢測器 )法快速測定雞肉、魚、蝦中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量， 4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚、蝦樣品中 3個(gè)不同水平的添加回收率 (n=7)為 87%~102%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為 %~%；工作曲線的線性范圍為 5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為 2μg/kg。 Angelini .等 [12]利用 LCUV方法檢測牛肌肉組織中四種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是 1mg/kg，定量限是 2mg/kg，平均回收率 76%。近年來各種色譜聯(lián)用技術(shù)分析法在硝基呋喃類抗生素的代謝物的檢測中應(yīng)用較多，發(fā)展迅速，主要是與質(zhì)譜聯(lián)用（包括串聯(lián)質(zhì)譜）。然而由于硝基呋喃類抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點(diǎn)，在動物體內(nèi)的半衰期不過數(shù)小時(shí)，通常不太可能檢出原藥的殘留，例如呋喃唑酮在停藥后 12h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物 3氨基 2惡唑烷酮 (AOZ)在動物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，在停藥后至少 6周內(nèi) AOZ在豬肌肉組織中繼續(xù)存在 [10]，因此當(dāng)原藥濃度降至檢測限以下時(shí)，檢測其代謝物濃度是可能的。此外，高通量的 96 孔板，可滿足處理大量樣品的要求。其他可供選擇的柱還有如 Waters Oasis HLB SPE、 Varian Bond Elut ENV/LMS、 Supelco Supelclean EnviChrom P、 JT Baker Bakernond H2Ophobic DVB、 IST Isolute101 等。用固相萃取柱可以從共萃取物中凈化和濃縮硝基呋喃萃取物。 基體固相分散技術(shù) （ MSPD） 基體固相分散技術(shù)是將硅藻土或非極性的 C18衍生硅膠等作為吸附劑，加入到樣品中，混合均勻，或者樣品與吸附劑一同研磨，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填第一章 引 言 7 充到層析柱中，用溶劑淋洗，達(dá) 到凈化的目的，該技術(shù)可以克服液液萃取過程中產(chǎn)生乳化的問題。 液液萃取 （ LLP） 液液萃取是最經(jīng)典、常用的凈化手段，可以用有機(jī)溶劑將待測物從溶液中萃取出來，或者將干擾物質(zhì)從有機(jī)相或水相萃取物中除 去。 樣品的凈化 通常，得到的水提取液或有機(jī)提取液中，目標(biāo)分析物濃度較低，還含有許多共萃取基質(zhì)，如果這些物質(zhì) 在最終的溶液中存在，不僅會干擾檢測，也會增加背景噪聲，無法測定痕量濃度的目標(biāo)分析物。 同樣地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白結(jié)合代謝物，經(jīng)酸水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 SEM、 AMOZ 和 AHD。通常水解選用稀鹽酸，濃度為 。在樣品的提取和去蛋白過程中，有機(jī)溶劑也能從內(nèi)源性大分子中萃取非共價(jià)鍵結(jié)合的殘留物。對于蝦類樣品的處理，先粉碎均勻，再冷凍儲存，但對其他肌肉組織、腎臟和肝臟等樣品，需要先冷凍，后選擇有代表性部分切成薄片，再進(jìn)一步粉碎。 （ 5）加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控。飼料生產(chǎn)企業(yè)要加強(qiáng)對生產(chǎn)原料的管理，做到原料來源清楚，記錄明確；要加強(qiáng)對原料檢測，重點(diǎn)加強(qiáng)對魚粉原料的檢測；要防止含有硝基呋喃類藥物的飼料原料投入生產(chǎn)，防止在生產(chǎn)過程中污染違禁藥物。 （ 2）加強(qiáng)獸藥生產(chǎn)經(jīng)營管理。 2021 年開始，我國將硝基呋喃納入殘留監(jiān)控計(jì)劃中。韓國 2021 年版《食品公典》規(guī)定豬肉中不得檢出呋喃唑酮。歐盟 (EU)N0807/2021 法規(guī)中，規(guī)定使用 HPLC 方法檢測呋喃唑酮，檢測限量 2ng/kg~4ng/kg。 硝基呋喃類藥物的管理對策 由于硝基呋喃類藥物殘留危害嚴(yán)重，美國、日本和歐盟等國家和地區(qū)紛紛采取措施，嚴(yán)加監(jiān)管。用呋喃唑酮對種雞進(jìn)行處理以后，代謝物殘留將按種雞 種蛋 雛雞 成雞的生物鏈條傳遞。通過對小白鼠和大白鼠的毒性研究表明，呋喃 唑酮可以誘發(fā)乳腺癌和支氣管癌，并且有劑量反應(yīng)關(guān)系；高劑量飼喂食用魚和觀賞魚，可誘導(dǎo)魚的肝臟發(fā)生腫瘤；繁殖毒性結(jié)果表明，呋喃唑酮能減少精子的數(shù)量和胚胎的成活率。在硝基呋喃類藥物中，以呋喃西林對家禽的毒性作用最常見，尤其是雛鴨和雛雞，以 220mg/kg混飼喂雛鴨或以 400mg/kg混飼喂雛雞，連續(xù)用藥 10天以上，出現(xiàn)呆滯、羽毛蓬松、厭食或興奮、驚厥癥狀，最后死亡。呋喃唑酮用于防治畜禽腸道感染，如兔球蟲病、豬痢疾、禽白痢、火雞黑頭病等 [2]。呋喃類藥物內(nèi)服后，吸收較少，吸收的部分在體內(nèi)迅速被破壞，血藥濃度低，不易達(dá)到有效濃度，不宜用于全身感染的治療。 關(guān)鍵詞 ： 液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜， 硝基呋喃類代謝物 ，內(nèi)標(biāo)法 英 文 摘 要 II Abstract A high performance liquid chromatographytandem mass spectrometric method was established for simultaneous determination of the nitrofuran metabolites, furazolidone, nitrofurazone and nitrofurantoin in animals， tissue and aquatic produces. Poteinbound metabolites were released in HCl solution and deriatised with 2nitrobenzaldehyde(2NBA)overnight at 37℃ . Proteins were sedmentated by nhexane , after adjusting pH to by sodium hydroxide. Then the analytes were extracted by ethyl acetate and cleaned up by nhexane. Identification was achieved by electrospray ionization in positive mode(ESI+) using multiple reaction monitoring(MRM).The quantification was performed with internal standards. The recoveries of 5methylmorpholino3amino2oxazolidinone (AMOZ), 3amino2 oxazolidimone(AOZ), semicarbazide(SEM) and 1aminohydantoin(AHD ) were in the range of %~%with spiked levels of ~2μg/kg. The RSDs were less than %. The limits of detection were , AOZ, SEM and AHD. Keywords: Liquid chromatographytandem mass spectrometric, metabolites of nitrofurans, internal standard. 目 錄 III 第一章 目 錄 摘 要 ................................................................................................. I ABSTRACT（英文摘要） ...................................................................... Ⅱ