【文章內(nèi)容簡介】 材料類型的不同其對重金屬的修復效果是不一樣的，其類型的不同，則磷的含量不同。一般地可溶性磷的含量越高，其對重金屬的固定能力越強 [19]；其次則是重金屬的濃度與種類也會對修復效果產(chǎn)生影響，磷灰石對溶液中的重金屬離子去除率順序為： Hg+ Mn2+Cu2+Zn2+Cd2+Pb2+[20]。另外，重金屬離子最初的濃度也會對修復的效果產(chǎn)生一定影響，重金屬離子的最初濃度越高，其修復效果會越小，二者呈現(xiàn)的一種負相 關關系 [21]； 還有反應溫度也會影響，通常情況下，在水溶液中其反應溫度定在 30— 40℃之間比較恰當，而處理時間在 2— 4 h，就可以基本達到平衡，隨著時間的增加修復效果也會更好一些 [22]。其他影響因素還包括了 PH 值、反應時間等。 目前在運用于重金屬修復土壤方面的修復劑，主要以磷酸鹽為主。磷酸鹽作為一種修復劑加入到土壤后，并改變不了重金屬的總量，而是通過降低重金屬在土壤中的有效性或者毒性，促使重金屬向殘渣轉(zhuǎn)化。尤其是以鉛最為明顯，根據(jù)Gao[23]等人的研究，加入磷酸鹽后有效鉛的濃度極大的降低了，使其向殘渣增 加11％ — 55％。磷酸鹽穩(wěn)定重金屬的機理是特別復雜的，其中主要包括磷酸鹽對重金屬直接吸附、誘導吸附，或者是與磷酸鹽發(fā)生沉淀反應三個方面。 磷酸鹽加入土壤后，也可能導致很多的環(huán)境問題。由于目前對磷的用量多少為最合適存在很大的分歧。 McGowen[24]等人認為，當為水溶性的磷 P/M=1/15(磷攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 緒論 6 與重金屬的摩爾比 )，而當為難溶性的磷時 P/M=3/5的修復效果是最好的。大多數(shù)的學者認為 P/M=3/5是最為恰當?shù)?，但是也有部分學者認為 P/M=[25]，如此大的變化幅度，的確讓人擔憂。磷酸鹽的大量施入后 ，可能會造成磷的淋失、營養(yǎng)富集等環(huán)境問題，也該引起重視。未來的研究中可能會更多的注重磷與重金屬的作用機理研究。 蠶豆根尖細胞學實驗的研究現(xiàn)狀與進展 蠶豆 (Vicia faba)又稱胡豆、佛豆、川豆、倭豆、羅漢豆。蠶豆屬于植物界、被子植物門、雙子葉植物綱、豆目、豆科、大豆屬。 一年生或二年生草本。為糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物。蠶豆一般認為起源于西南亞和北非。中國的蠶豆，相傳為西漢張騫自西域引入。自熱帶至北緯63176。地區(qū)均有種植。中國以四川最多，四川攀枝花涼山州更是盛產(chǎn)蠶豆。次為云南、貴州、湖南、 湖北、江蘇、浙江、青海等省。蠶豆株 高 30— 180 厘 米。莖直立，四棱，中空，四角上的維管束較大。羽狀復葉。總狀花序，花蝶形。莢果，種子扁平，略呈矩圓形或近于球形。蠶豆花期一般 是 3— 5 月。 蠶豆為長日照作物。喜溫暖濕潤氣候和 — 8 的粘壤土。蠶豆子粒蛋白質(zhì)含量約 25%— 28%，含 8 種必需氨基酸。碳水化合物含量 47%— 60%?？墒秤茫部芍漆u、醬油、粉絲、粉皮和作蔬菜。 蠶豆是一種廣為種植，營養(yǎng)價值很高的經(jīng)濟作物 [26]。 蠶豆根尖細胞分裂明顯，并且其蠶豆的染色體由六組較大的染色體組成，這些特征使得蠶豆易于在顯微鏡下觀察其細胞分裂情況。蠶豆根尖細胞還是一種很好的細胞遺傳學研究材料。放射生物學家們早在 1959 年就已經(jīng)用蠶豆的根尖細胞來進行 x射線的遺傳損傷研究。到了 70 年代的時候，蠶豆根尖細胞染色體畸變技術就發(fā)展得相當成熟。作為一種檢測化學品遺傳學毒性的方法為人們所知，并且被廣泛的應用。在染色體畸變實驗的基礎上， 1982 年由 degrassi和 Rizzoni 正式介紹蠶豆的 微核實驗 [27]。該實驗則是用微核出現(xiàn)的頒率來評價環(huán)境誘變因子對生物遺傳物 質(zhì)的損傷程 度 [28]。顯得更為簡單方便。我國則是在 1985 年發(fā)表 了首篇用蠶 豆根尖微核試驗直接檢測淡水湖泊水質(zhì)污染的論 文 [29]。而目前 建立在染色體畸變實驗基礎上的微核實驗也得到廣泛的應用。 蠶豆根尖的細胞學試驗也被美國的國家環(huán)保局肯定了在環(huán)境突變性檢測中的作用，許多的環(huán)境致癌物都用蠶豆根尖細胞做了標準化試驗，并且建立了巨大的相關數(shù)據(jù)庫，同時建議在全球范圍 推廣 [30]；其 又被國際上推薦作為為檢查誘變劑、致癌劑常用遺傳學毒理方法之一。 染色體形態(tài)的畸變是因為染色單體或染色體的斷裂造成了染色單體或染色體的丟失，或者是導致了各種重排現(xiàn)象，進而出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)異常的染色體。重金屬攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 緒論 7 引起染色體形態(tài)畸 變的原因是多種多樣的，其中主要有： DNA 造成損傷； 擾亂 DNA 和有關蛋白質(zhì)合成，以及干擾 RNA 轉(zhuǎn)錄的過程，進而使與染色體移動的相關物質(zhì)幾乎不能合成或者是合成量遠遠的減少，不能滿足正常的活動的需要 ； 色體造成損傷過后不能修復，重接形成新的染 色體 [31]。 攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 實驗方案與過程 8 2 實驗方案與過程 實驗藥品與儀器 藥品：無水乙醇 — AR、冰乙酸 — AR、鹽酸 — AR、堿性品紅 — AR、甲醛 —AR、石炭酸 — AR、次氯酸鈉 — AR、氯化錳 — AR、磷酸 二氫鉀 — AR、 山梨醇 —BR。 儀器：醫(yī)用托盤、培養(yǎng)皿、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、水浴鍋、醫(yī)用脫脂棉、普通光學顯微鏡、數(shù)碼顯微鏡 —— Nikon200，數(shù)碼相機 —— 三星 ES5常規(guī)玻璃儀器。 實驗試劑的配制 500ml4mmol/LMnCl2溶液的配制：首先稱取四水氯化錳 于 100ml 小燒杯中溶解，在用 500ml容量瓶定容，最后轉(zhuǎn)入 500ml試劑瓶保存?zhèn)溆谩? 100ml26mmol/LKH2PO4溶液的配制：首先稱取 100ml小燒杯中。再用 100ml容量瓶定容。 最后轉(zhuǎn)入試劑瓶保存?zhèn)溆谩? 卡洛氏 固定液的配制：取無水乙醇三份與一份冰乙酸混勻即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。 染液的配制：依次如下配制 A 液、 B 液、 C 液，最后才配成染液。 A 液，首先稱取 3g堿性品紅溶于 100ml70%乙醇配制成 A 液，可以長期保存； B 液，取 A 液 10ml 加入 90ml 的 5%的石炭酸水溶液配制成 B 液，在兩周內(nèi)使用； C 液，取 B 液 55ml加入冰乙酸和福爾馬林各 6ml配制成 C 液； 染液，取 C 液 20ml 加入 45%的乙酸 70ml，再加入山梨醇 ，5天后使用著色效果較好。 實驗材料 攀枝花當年產(chǎn) 蠶豆 實驗方法 在本次實驗中設置一個對照組， 5 個試驗組。其中 1 號為蒸餾水對照組，即只用 2mmol/LMnCl2 溶液。 6 號為分別用 13mmol/L、 、 、 液共同處理的實驗組。每一個不同濃度組鏡檢 5 個根尖，而每一個根尖計數(shù) 1000個的分生區(qū)細胞，則一組計數(shù)共 5000 個分生區(qū)細胞，共進行三次平行試驗。 攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 實驗方案與過程 9 實驗過程 浸種 選取蠶 豆顆粒飽滿，大小形狀幾乎一致的蠶豆 70粒用 %的 NaClO 溶液200ml 浸洗 10min。然后用蒸餾水沖洗三次，最后于 1000ml 燒杯中加水 500ml 在20℃條件下浸泡 24— 27h待其吸脹。 催芽 于醫(yī)用托盤上先鋪蓋兩層醫(yī)用脫脂棉，然后用 150ml蒸餾水使其浸濕，在整齊擺放已吸脹蠶豆于醫(yī)用脫脂棉上，最后蓋上一層醫(yī)用脫脂棉保濕，并在 24℃培養(yǎng)箱中催芽 42h待根長長至 — 2cm左右，且 24h 后補充水分 100ml。 染毒 將 6個 100ml 洗凈的小燒杯編號為 6，在 1號燒杯加入 20ml蒸餾水， 2號燒杯加入 20ml26mmol/LKH2PO4溶液，用 5ml的移液管將已經(jīng)配制好的 KH2PO4溶液移取 3ml于 3號燒杯中稀釋 10倍；取 3號已稀釋液 3ml 于 4號燒杯中稀釋 10倍；取 4號稀釋液 3ml于 5號燒杯中稀釋 10倍；最后取 5號稀釋液于 6號燒杯中稀釋 10倍，則配制成 5個濃度梯度的 KH2PO4溶液。將 6號燒杯中的稀釋液分別量取 20ml 于 6號燒杯中，最后在 6號燒杯中分別加入 20ml4mmol/L 的 MnCl2溶液配制成所需培養(yǎng)液。將洗凈的 12個培養(yǎng)皿分成 6組，預先墊放兩層 醫(yī)用紗布，按下表 ，每個培養(yǎng)皿整齊擺放 5粒蠶豆，并且蓋上一層紗布保濕，在 24℃條件下進行染毒 24h。 固定 將已經(jīng)染毒 24h 的 6組蠶豆根尖截取 1cm 左右于 6個小燒杯中用 20ml 蒸餾水浸洗 5min 后，在用蒸餾水沖洗一次后于 6個已經(jīng)編號為 6的塑料杯中進行固定，每個塑料杯加 10ml 現(xiàn)配固定液，最后蓋上蓋子在室溫條件下固定 5— 9h后分，用 95%乙醇浸洗 10min后轉(zhuǎn)入 70%乙醇中保存?zhèn)溆谩? 解離 取蠶豆根尖 5個先用蒸餾水浸洗 兩次，每次用 10ml蒸餾水浸洗 5min，再切去根冠后于 100ml 小燒杯中加入 10ml1mol/L 鹽酸在 60℃水浴條件下解離 3— 4min，至根尖酥軟。 染色 取已經(jīng)解離根尖先用蒸餾水浸洗兩次，每次用 10ml 蒸餾水浸洗 5min，然后取出根尖切取分生區(qū)部位 — 1mm 左右于載玻片上滴 3— 5滴染液染色 40—50min。 制片 用蒸餾水洗去染液，然后于載玻片上滴上一滴蒸餾水，輕輕蓋上蓋玻片，用攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 實驗方案與過程 10 濾紙在一邊吸去蒸餾水后，用大拇指適當用力壓蓋玻片后，在用中性筆尾輕輕敲片，直到細胞均勻分散為止。 表 實驗處理以及分組 一組 二組 三組 四組 五組 六組 1 139。 2 239。 3 339。 4 439。 5 539。 6 639。 1 號液 (ml) 20 20 __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ 2 號液 (ml) __ __ 20 20 __ __ __ __ __ __ __ __ 3 號液 (ml) __ __ __ __ 20 20 __ __ __ __ __ __ 4 號液 (ml) __ __ __ __ __ __ 20 20 __ __ __ __ 5 號液 (ml) __ __ __ __ __ __ __ __ 20 20 __ __ 6 號液 (ml) 20 20 鏡檢計數(shù) 將已經(jīng)制好的裝片于顯微鏡下鏡檢計數(shù)，首先在 40倍鏡下找到視眼，在 100倍鏡下找到著色均勻，細胞分散均勻，且細胞多數(shù)為正方形或者圓形同時有較多分裂象的視眼。然后轉(zhuǎn)在 400倍鏡下進行計數(shù)。 照相 本實驗拍照分為實驗過程拍照和顯微拍照。實驗過程拍照主要是針對在實驗過程中的一些重要實驗步驟進行拍照，顯微照相主要是對染色體畸變細胞進行照相，準確展示染色體畸變形態(tài) 。同時還要進行一些實驗步驟的錄像，記錄實驗的操作過程。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 計算公式： 細胞分裂指數(shù)（ M） =分裂的細胞總數(shù) /總細胞數(shù)‰ 平均細胞分裂指數(shù)（ ） =（ M1+M2+M3） /3 攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 實驗方案與過程 11 染色體的畸變率（ Z） =染色體畸變的細胞總數(shù) /分裂的細胞總數(shù)％ 平均染色體的畸變率（ ） =（ Z1+Z2+Z3） /3 攀枝花學院本科畢業(yè)設計（論文） 結(jié)果與分析 12 3 結(jié)果與分析 磷在錳的脅迫下對蠶豆根尖細胞分裂指數(shù)與染色體畸變率的影響 表 磷在錳的脅迫下對蠶豆根尖細胞分裂指數(shù)（ ‰ ）與染色體畸變率（ ％ ）的影響 染色體短片細胞數(shù) 染色體粘連細胞數(shù) 落后染色體細胞數(shù) 染色體橋細胞數(shù) 染色體環(huán)細胞數(shù) 畸變分裂細胞總數(shù) 正常分裂細胞數(shù) 鏡檢細胞總數(shù) M3 ‰ Z3 ％ 一組 57 41 12 0 0 110 102 5000 二組 64 11 2 0 1 78 82 5000