【文章內容簡介】 抗菌、抗病毒等生物活性。近年 來研究人員不斷探索殼聚糖衍生物的制備，以求提高殼聚糖水溶性、專一性、 高效性，使之廣泛用于農業(yè)、工業(yè)、食品業(yè)、化妝品業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)等，實現(xiàn)產 業(yè)化生產。 殼聚糖 衍生物 抗病毒活性概述 海洋生物多糖從來源上可分為海藻多糖和海洋 動物多糖，目前多種海洋微生物也被發(fā)現(xiàn)可產生生物活性多糖 [58]。 多糖是生命有機體的重要組分，并在控制細胞分裂、調節(jié)細胞生長以及維持生命有機 體正常代謝等方面具有重要作用 ，主要影響免疫系統(tǒng)中的網狀內皮系統(tǒng)、巨噬細 胞、淋巴細胞及白細胞，促成RNA、 DNA、蛋白質的合成、抗體的生成、補體的生成以 及對干擾素的作用，從而增強機體免疫功能，使抗病毒能力增強， 從而達到抗衰老、抗放射線、抗腫瘤以及抗肝炎等目的 [59] [60]。 海洋動物多糖中， 殼聚糖具有激活機體 免疫 系統(tǒng)、介導機體 免疫 系統(tǒng)的系列生物學效應 ， 提高吞噬細胞的系統(tǒng)功能 ， 而被認為是解決病毒性疾病等難題的關鍵。 殼聚糖作為抗病毒藥物的載體的研究已經屢見不鮮 [6163]，這與其良好的免疫活性、生物相容性、可降解性及其良好的控釋效果是分不開的。殼聚糖作為單獨的抗病毒藥物可抑制幾十種植物病毒、類病毒的侵染，如對大豆花葉病毒和煙草花葉病毒，并對植物病毒種類沒有明確的局限性 [64, 65]，但與殼聚糖的分子量、聚合度、濃度及植物宿主種類有關。 殼聚糖的抗病毒 機制為促進巨噬細胞活性，影響非殺傷性細胞（ NK）活性白介素的分泌， 刺激輔助 T細胞的生長， 這也是其抗癌的主要機理之一 [28]。 巨噬細胞是抗原呈遞細胞，與輔助 T細胞聯(lián)系后，啟動體液和細胞免疫系統(tǒng) [66]。 巨噬細胞表面存在著 微生物 多糖的受體， 殼聚糖作為 微生物 多糖的類似物，能刺激巨噬細胞活化，產生如 下反應：摘要 11 促進其吞噬功能，增強它在其它免疫應答中的 協(xié)同效應，從而實現(xiàn)機體對 T細胞、 NK 細胞和 B細胞的調節(jié)，介導機體的細胞免疫應答和體液 免疫應答； 此外， 殼聚糖 被認為有 干擾 遺傳物質 的復制與轉錄 的功能， 殼聚糖通過誘導病程相關蛋白，積累次生代謝產物和信號傳導等方 式來達到抗菌 、抗病毒 的目的。殼聚糖作為抗病毒藥物的載體的研究已經屢見不鮮 [6163]， 而 作為單獨的抗病毒藥物 ， 可抑 制幾十種植物病毒、類病毒的侵染，如對大豆花葉病毒和煙草花葉病毒。殼聚糖 對植物病毒種類沒有明確的局限性 [64, 65]，而與自身的 分子量、聚合度、濃度 等 有關。經過衍生化修飾的殼聚糖 ， 一方面 能夠調控與免疫相關的輔助細胞的功能活性，如巨噬細胞和粒細胞等 。另一方面巨噬細胞和自然殺傷性細胞的相互作用誘導干擾素的產生，干擾素通過破壞基因組 RNA或早 期mRNA而破壞轉錄，抑制病毒復制，因而在動物病毒的防治上也具有廣泛的應用基礎 [66]。 殼聚糖衍生物作為抗病毒首要的開發(fā)前景 海洋多糖來源豐富， 由于生長環(huán)境不同， 海洋動物、海洋植物以及海洋微生物都能合成出不同于陸地植物的帶有大量電 荷、含有糖醛酸及硫酸酯的多糖。隨著陸地資源的消耗，海洋生物多糖的作用逐 漸被發(fā)現(xiàn)，它不僅具有明顯的生物學活性，而且無毒副作用 [60]， 具有抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化、抗病毒 以及作用于心腦血管等活性，海洋生物活性多糖 的研究開發(fā)已成為一個熱門領域[58]。 海帶多糖和大部分的海藻多糖等都具有免疫調 節(jié)作用 [67]，海藻細胞壁中的多聚硫酸脂多糖能阻止小鼠自身免疫系統(tǒng)腦脊 髓炎的發(fā)生；鈍頂螺旋藻多糖可提高病人殺傷細胞的細胞活性；寡褐藻膠，寡 幾丁質等寡聚糖片段能在病原侵入時啟動植物的防御機制，誘導植物自身抗性 基因的表達，達到防御植物病害的目的，多種海洋多糖已被制成藥物和保健品 出現(xiàn)在市場上 [68]。 殼聚糖具有如抗凝、溶栓、降血糖、抗氧化、 抗腫瘤、抗炎、抗細菌、抗病毒、抗原蟲等生物活性 ， 能 激活機體 免疫 系統(tǒng)和介導機體系統(tǒng)的系列生物學效應，提高吞噬細胞的系統(tǒng)功能。 1958 年， GERBER首次報道了多糖硫酸酯 具有抗病毒活性，能強烈抑制具有包膜的病毒， DEREK HORTON 和 ERNST 殼聚糖氨基 上含有 硫酸根 對白血病病毒具有顯著抑制作用。致謝 VERCELLOTTI 和 SHARON 等人發(fā)現(xiàn)殼聚糖磺化衍生物能抑制哺乳動物病 毒感染 ， 同時也能抑制勞舍氏白血病病毒和單純皰疹病 毒 I 和 II[69]。CHIAKIISHIHARA等人證明甲殼質磺化衍生物對弗蘭德鼠白血病 病毒、仙臺病毒和單純皰疹病毒有作用 [34, 70]。 因此， 基于殼聚糖在抗病毒方面的優(yōu)異表現(xiàn) ，我們 以 不同結構類型的殼聚糖 為原料，進行分子量和氨基化的修飾，以提高 其反應活性，并試驗其 對雞新城疫病毒的抑制作用 研究， 通過雞胚試驗 、分子實驗 等，對殼聚糖的 修飾、濃度以及 分子量等對 新城疫 病毒 的抑制 活性進行深入研究。 研究的內容 、 目的和意義 近年來，由于環(huán)境污染及病毒基因組的變異性 ，許多前所未聞的病毒進入人們的視野，引起恐慌。從艾滋病、禽流感到 埃博拉病毒，每一次 病毒 的出現(xiàn)都給人類社會造成巨大影響， 且 病毒性疾病的發(fā)生與腫瘤 這一醫(yī)療難題 也是息息相關 [71]。因此， 人類 與病毒性疾病的戰(zhàn)役，已經不能 只 簡單的 進行 被動抵抗了，而必須進行強有力的反擊。 新城疫作為 危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的三大主要疫病之一，不 僅給我國的家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失，同時由于疫情 的發(fā)展，還極大的影響了旅游等相關產業(yè)的發(fā)展。 雖然目前由于新城疫病毒的多發(fā)性而被我國規(guī) 定為強制免疫病種，在政府組織下進行集中免疫 [72]。 然而，由于病毒的變異性及疫苗本身及接種程序所存在的 問題 ，導致目前主要的防治 新城疫的手段 ——疫苗接種，面臨極大的考驗。 近年來 ， 隨著經貿的發(fā)展和交往的頻繁 ， 新城疫病毒的流行又有了新的特征，疫苗免疫尚不完善，抗病毒化 學藥物 效果不顯著， 導致 至今尚無有效的治療藥物 [73]。 而且，作為免疫損傷性疾病，對于新城疫 的研究是對艾滋病、禽流感等人類迫切想要解決的免疫損傷 性疾病的研究基礎。 海洋藥物已成為國內外研究的熱點之一。由于 海洋生物特殊的生活環(huán)境導致體內多糖的合成過程與陸地生物不同，產生 許多結構新穎、作用獨特的海洋生物多糖 [1112]，而具有很好的生物相容性、生物可降解性的 天然陽離子多糖—— 殼聚糖即為其中一種 。 海洋生物多糖殼聚糖，其分子中含有正電性的 氨基，摘要 13 具有非常好的生理活性，如調節(jié)免疫、抗腫瘤 、抗菌、保濕性等，且研究發(fā)現(xiàn)，其可抑制幾十種植物病毒、類病毒的侵染 。 目前國內外對于 殼聚糖及其衍生物抑制雞新城疫病毒的研究尚未見報道， 不同 分子 構型 、 不同 分子量 殼聚糖 及其衍生物對新城疫病毒 抑制 的 系統(tǒng)性 研究 是首要需解決的關鍵性問題之一 。 因此，我們通過微波方法 及接枝 技術 制備不同 分子構型、不同 分子量的高脫乙酰度殼聚糖 及其胺代衍生物 ， 并以此為 研究對象， 對雞胚尿囊液中血凝效價的降低作用 為指標 ， 篩選出最佳 分子構型、 分子量 及衍生物產品 ；同時，采用熒光定量PCR技術，測定細胞因子在分子及蛋白水平的變化 ，以此確定殼聚糖 衍生物 在對抗 新城疫 病毒的過程中，對于免疫系統(tǒng)的激活與調控， 從而確定殼聚糖 衍生物 對于機體免疫系統(tǒng)的影響及藥效機制 ， 為殼聚糖硫酸酯成為預防與治療 新城疫 病毒的藥物打下堅實的理論基礎。 致謝 第二章 不同 分子量 α殼聚糖 的 制備 及 其 抗新城疫病毒 活性 研究 傳統(tǒng)的抗病毒藥物往往存在毒副作用大或是交叉產生病毒抗藥性等特點，因此 ， 亟待開發(fā)毒副作用小、抗病毒活性好的新型抗病毒藥物 [74]。殼聚糖 作為天然聚合物有很好的生物相容性、生物可降解性、無毒性以及吸收性等 ， 應用在水處理、生物醫(yī)藥、化妝品、農業(yè)和食品工業(yè) 等多領域 ，具有免疫、抗菌、抗病毒 、 傷口愈合、藥物遞送、組織工程應用等生物活性 [35, 36]。 殼聚 糖 分子量的降低，由于 導致 溶解性 的 增加 而 有利于殼聚糖活性的釋放 ，可 顯著提高其抗腫瘤 、 抗菌 、 抗炎 及免疫調控活性 [75]。本文采用過氧化氫微波輔助方法，降解α殼聚糖分子量在 1kDa10kDa 之間，并采用雞胚實驗及相關分子實驗，測定新城疫病毒血凝效價的變化及經過治療后的雞胚尿囊液中免疫因子 IL TLRIFNα/β及 TNFα的變化 ， 對殼聚糖 影響 新城疫 病毒的 RNA 含量也進行了測定 。 實驗原料 原料 殼聚糖原料（ 青島 云宙生物科技 有限公司 ，脫乙酰度為 82%分子量為1160kDa）； SPF 雞胚 （ 山東無特定病原雞實驗種雞場 ，符合 GB/ 以及國際通用標準 ） ； 試劑 氫氧化鈉 (分析純，天津市達森化工產品銷售公司 )； 乙酸鈉 (優(yōu)級純，天津市科密歐化學試劑有限公司 )； 冰醋酸 (高效液相色譜，天津市科密歐化學試劑有限公司 )； 反轉錄試劑盒 （ TransScript174。 OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix， 北京全式金生物技術有限公司 ） ； 摘要 15 熒光定量試劑盒 （ TransStart174。 Top Green qRTPCR SuperMix， 北京全式金生物技術有限公司 ） ； 過氧化氫 （ 分析純 ，天津市巴斯天化工有限公司 ） ； 病毒 ，由？提供。 （ LASOTA 雞新城疫病毒，原始病毒效價為 211， 96h 內致雞胚死亡） ； 儀器 微波降解反應器 （ MASII 型，上海 新儀 微波化學 科技 有限公司） ； 透析袋（ MEMBRACEL，截留分子量為 500/1000/5000Da） ； 安捷倫 1260 凝膠滲透色 譜 儀 (美國安捷倫科技公司 )； Nicolet TM iSTM10 傅立葉變換紅外光譜儀（ Thermo， USA） ； SHZD（ III）型循環(huán)水式真空泵 （ 河南鞏義市英峪豫華儀器廠 ）； FD1A50 型冷凍干燥機 （ 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司 ） ； SARTORIUS 精密分析天平 （ 德國 SARTORIUS 公司 ） ； HitechKflow純化水系統(tǒng)（ 上海和泰儀器有限公司 ）； Anke GL20911 型高速離心機 （ 上海安亭科學儀器廠 ）； DHG9030A型 電熱恒溫 鼓風干燥箱 （上海精 宏 實驗設備有限公司 ） ； 旋轉蒸發(fā)儀（ IKA RV/HB digital） ； 實驗方法 α殼聚糖的降解 [75] 稱取 α殼聚糖 12g，分子量為 1160kDa、脫乙酰度為 82%，溶解于 400mL濃度為 2%的冰乙酸溶液（體積濃度），攪拌溶解直至獲 得澄清、均質的 α殼聚糖 溶液 。將 50mL 溶解后的 α殼聚糖倒入 100mL 微波反應器中，加入 30%過氧化氫 ， 600W， 70℃ 條件下，攪拌 500 r/min， 依次反應 10min、 15min、20 min、 25min、 30min、 40min、 60min、 80 min、 100min、 180min， 將獲得的溶液透析、凍干并進行分子量及結構的測定。 采用高效凝膠排阻色譜對 α殼聚糖降解產物的 平 均分子量（ Mw） 進行分析。 致謝 分子量的測定 高效液相法測定殼聚糖樣品分子量： 進樣量： 20μL； 色譜柱： TSK G3000PWXL、 TSK G5000PWXL；流動相： 醋酸 / 醋酸鈉溶液；流速： mL/min ， ；柱溫： 30℃ ；檢測器：示差檢測器；樣品濃度： %（ W%）； 采用不同分子量的葡聚糖 20xx、 1100、 670、 4 270、80、 50、 1 1kDa，對凝膠色譜柱進行校準。 低分子量 α殼聚糖抗新城疫病毒效果研究 [1, 73, 76] A) 新城疫病毒毒力測定 EID50的測定： 取雞胚 30 枚，分 6 組，分別注射 10 10 10 10 10 109病毒原液 生理鹽水稀釋液 ， 37℃ 孵育 72 小時后收取尿囊液，測定 EID50=，取 150EID50≈ 106 為 病毒注射量。 B） 低分子量 α殼聚糖安全濃度測定 ： 將 不同分子量的 α殼聚糖 配成 20g/L、 10g/L、 5g/L生理鹽水溶液， 分別注射尿囊腔，觀察 96 小時內，完全成活，繼續(xù)培養(yǎng)至出殼，雞胚外 觀健康完整，無殘疾。 注： SPF 胚對病毒相對敏感，對藥物的耐受也更為敏感 ，雖然 96 小時內完全成活，但繼續(xù)培養(yǎng)至出殼，有狀態(tài)不佳未能 成活，但孵育率為 86%，在 70%可靠值以上。 C)低分子量 α殼聚糖 抗新城疫病毒 藥效測定 C1)直接抑制：將不同濃度藥物與新城疫病毒混勻 后按照 1:1（ v/v） 的比例接種于雞胚尿囊腔， 72 小時后收取尿囊液，測定其血凝效價。 低濃度直接抑制試驗：分別將分子量為 992 837 451 276 262239 196