【文章內(nèi)容簡介】 產(chǎn)量從 90 年代的初的約占世界總產(chǎn)量的三分之一逐步增加到目前的 90%以上。中國青霉素行業(yè)發(fā)展迅速。目前中國青霉素工業(yè)鹽產(chǎn)能已達(dá) 10 萬噸 /年，而每年全球需求量也只有 5— 6 萬噸，將青霉素作為制備其他抗生素母核的原 料，讓絕大部分抗生素品種擺脫了依賴進(jìn)口的局面。面對(duì)國際市場(chǎng)對(duì)青霉素產(chǎn)品的需求的減弱和國內(nèi)市場(chǎng)抗生素產(chǎn)品的升級(jí)，可知我國的青霉素需求量還是呈上升趨勢(shì)。 青霉素分子結(jié)構(gòu)及分類 青霉素是 6－氨基青霉烷酸（ 6aminopenicillanic acid， 6APA）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素 G。工業(yè)上應(yīng)用的有 鉀 、 鈉 、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽 ，其在水中溶解度很小，且很快失去活性。 青霉素的分子通式為： RC9O4H11 N2 S 第一章 緒論 3 結(jié)構(gòu)通式可表示為下圖： 圖 11 青霉素結(jié)構(gòu)通 式 然而青霉素發(fā)酵液中含有 5 種以上天然青霉素（如青霉素 F、 G、 X、 K、 F 和 V 等），它們的差別僅在于側(cè)鏈 R 基團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，其中青霉素 G 在醫(yī)療中用得最多，它的 鉀 或 鈉 鹽為治療革蘭氏陽性菌的首選藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌也有強(qiáng)大的抑制作用 。 青霉素的單位 目前國際上青霉素活性單位表示方法有兩種：一是指定單位（ unit）；二是活性質(zhì)量（ μg），最早為青霉素規(guī)定的指定單位是： 50mL 肉湯培養(yǎng)基中恰能抑制標(biāo)準(zhǔn)金葡萄菌生長的青霉素量為一個(gè)青霉素單位。在以后，證明了一個(gè)青霉素單位相當(dāng)于 青霉素鈉。因此青霉素的質(zhì)量單 位為 : 青霉素鈉等于 1 個(gè)青霉素單位。由此， 1mg 青霉素鈉等于 1667 個(gè)青霉素單位 (unit)。 作用機(jī)理 有研究認(rèn)為，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān) [1]。細(xì)菌的細(xì)胞壁是一層堅(jiān)韌的厚膜，主要由多糖組成，也含有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，用以抵抗外界的壓力，維持細(xì)胞的形狀。細(xì)胞壁的里面是細(xì)胞膜，膜內(nèi)裹著細(xì)胞質(zhì) ， 青霉素作用于 β內(nèi)酰胺類細(xì)菌的細(xì)胞壁 。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的組成是肽聚糖占細(xì)胞壁干重的 50％～ 80％（革蘭氏陰性菌為 1％～ 10％）、磷壁酸質(zhì)、多糖 、 脂蛋白和蛋白質(zhì)。其中肽聚糖是一種含有乙?；?葡萄糖胺和短肽單元的網(wǎng)狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關(guān)鍵的酶即轉(zhuǎn)肽酶。青霉素作用的部位就是這個(gè)轉(zhuǎn)肽酶。現(xiàn)已證明青霉素內(nèi)酞胺環(huán)上的高反應(yīng)性肽鍵受到轉(zhuǎn)肽酶活性部位上絲氨酸殘基的羥基的親核進(jìn)攻形成了共價(jià)鍵，生成青霉噻唑?；?酶復(fù)合物，從而不可逆的抑制了該酶的催化活性。通過抑制轉(zhuǎn)肽酶，青霉四川理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) 4 素使細(xì)胞壁的合成受到抑制，細(xì)菌的抗?jié)B透壓能力降低，引起菌體變形，破裂而死亡。即 作用 機(jī)理 是干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。 因?yàn)?青霉素的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞壁的成分粘肽結(jié)構(gòu)中的 D丙氨酰 D丙氨酸近似，可與后者競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn) 肽酶 ，阻礙 粘肽 的形成，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交連橋的結(jié)合而阻礙細(xì)胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用。造成細(xì)胞壁的缺損，使細(xì)菌失去細(xì)胞壁的滲透屏障，對(duì)細(xì)菌起到殺滅作用。對(duì)革蘭陽性球菌及革蘭陽性桿菌、 螺旋體 、 梭狀芽孢桿菌 、 放線菌 以及部分 擬桿菌 有抗菌作用。 對(duì) 溶血性鏈球菌 等 鏈球菌屬 ， 肺炎鏈球菌 和不產(chǎn) 青霉素酶 的葡萄球菌具有良好抗菌作用。對(duì)腸球菌有中等度抗菌作用 。 對(duì) 流感嗜血桿菌 和百日咳鮑特氏菌亦具一定抗菌活性 ， 對(duì)梭狀芽孢桿菌屬、消化鏈球菌、 厭氧菌 以及產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌等具良好抗菌作用。 青霉素的應(yīng)用 臨床應(yīng)用： 40 多年 來 ，主要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體有抗菌作用。優(yōu)點(diǎn)：毒性小，但由于難以分離除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起過敏反應(yīng)），需要皮試。 產(chǎn)品藥理 青霉素 為β內(nèi)酰胺抗生素對(duì)革蘭陽性菌及某些革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，金黃色葡萄球菌 (金葡菌 )、肺炎球菌、淋球菌及鏈球菌等對(duì)本品高度敏感；腦膜炎雙球菌、破傷風(fēng)桿菌 、 白喉?xiàng)U菌及梅毒螺旋體也很敏感。主要用于敏 感菌引起的各種急性感染，如肺炎、支氣管炎、腦膜炎、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、膿腫、敗血癥、蜂窩組織炎、乳腺炎、淋病、回歸熱、鉤體病、梅毒、白喉及中耳炎等。 對(duì)溶血性鏈球菌等鏈球菌屬，肺炎鏈球菌和不產(chǎn)青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。對(duì)腸球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉棒狀桿菌、炭疽芽孢桿菌、牛型放線菌、念珠狀鏈桿菌、李斯特菌、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體對(duì)本品敏感。本品對(duì)梭狀芽孢桿菌屬、消化鏈球菌厭氧菌以及產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌等具良好抗菌作用，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用。 第二章 工藝設(shè)計(jì) 5 第二章 工藝設(shè)計(jì) 青霉素的生 產(chǎn)原料 菌種 常用菌種為產(chǎn)黃青霉（ Pen chrysogenum ）。當(dāng)前生產(chǎn)能力可達(dá) 50000— 90000μ /ml。按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)，可分為球狀菌和絲狀菌。今常用綠色絲狀菌為代表。 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基成分為： ⑴ 碳源 青霉菌能利用多種碳源和乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前普遍采用淀粉經(jīng)淀粉酶水解的葡萄糖糖化液（ DE值 50%以上）進(jìn)行流加。 ⑵ 氮源 選用玉米漿、玉米餅粉等并補(bǔ)加無機(jī)氮源。 ⑶ 前體 微生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素 G，需在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。一次加入量不能大于 %，并采用多次加入方式。 ⑷ 無機(jī)鹽 包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵離子的含量在 30 μ /ml以下。 青霉素發(fā)酵過程 青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個(gè)階段 [2] 菌體生長階段 發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時(shí)間的適應(yīng)，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達(dá)到菌體的臨界濃度。這個(gè)階段主要是碳源（包括糖類、脂肪等）和氮源的分解代謝，以及菌體細(xì)胞物質(zhì)的合成代謝變化，前者的代謝途徑和后者有機(jī)地聯(lián)系在 一起，碳源、氮源和磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，新菌體不斷合成。隨著菌體四川理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) 6 濃度的不斷增加，攝氧率不斷增大，溶解氧水平不斷降低。當(dāng)達(dá)到菌的臨界濃度時(shí)，攝氧率達(dá)到最大，溶解氧降至最小。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗達(dá)到一定程度，菌體生長達(dá)到一定濃度，或者溶解氧的供應(yīng)下降到某一水平，即成為限制因素時(shí)，菌體生長速度減慢；同時(shí)，由于菌體的某些中間代謝產(chǎn)物的迅速積累、原有的酶活力下降以及出現(xiàn)與抗生素合成有關(guān)的新酶等原因，導(dǎo)致生理階段的轉(zhuǎn)變，發(fā)酵就從菌體生長階段轉(zhuǎn)入青霉素合成階段。 青霉素合成階段 這個(gè)階段主要合成青霉素，青霉素的生產(chǎn)速 率達(dá)到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強(qiáng)度一般無顯著變化。這期間以碳源和氮源的分解代謝和青霉素的合成代謝為主，前者的代謝途徑和后者有機(jī)地聯(lián)系在一起，碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，青霉素不斷合成。此外，由于存在著抗生素合成和菌體合成二條不同的代謝途徑，需要嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，以利抗生素合成代謝的進(jìn)行。一般在這個(gè)階段，發(fā)酵液中碳源、氮源和磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度必須控制在一定范圍內(nèi)，才有利于青霉素合成；如果這些物質(zhì)過多，則只會(huì)促進(jìn)菌體生長，抑制青霉素合成；如果這些物 質(zhì)過少，則菌體容易衰老，青霉合成能力也會(huì)衰退，對(duì)生產(chǎn)不利。除此之外，發(fā)酵液的 pH 值、溫度和溶解氧濃度等都會(huì)影響發(fā)酵過程中的代謝變化，進(jìn)而影響青霉素產(chǎn)量，必須予以嚴(yán)格控制。 此階段一般又稱為青霉素分泌期或發(fā)酵中期。 菌體自溶階段 這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加， pH 上升。此時(shí)發(fā)酵必須結(jié)束，否則不僅會(huì)使青霉素受到破壞，還會(huì)給發(fā)酵液過濾和提煉帶來困難。 此階段一般又稱為菌體自溶期或發(fā)酵后期。 生產(chǎn) 工藝 青霉素的生產(chǎn)方法有產(chǎn) 天然青霉素 法和青霉素 半 合成 法。 天然青霉素的生產(chǎn)方法 天然 青霉素 G 生產(chǎn)可分為菌種發(fā)酵和提取精制兩個(gè)步驟。 ① 菌種發(fā)酵：將產(chǎn)黃青霉菌接種到固體培養(yǎng)基上，在 25 ℃ 下培養(yǎng) 7～ 10 天，即可得青霉菌孢子培養(yǎng)物。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種子罐內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣、攪拌，第二章 工藝設(shè)計(jì) 7 在 27 ℃ 下培養(yǎng) 24～ 28h，然后將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐已滅菌的含有 苯乙酸 前體的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，攪拌，在 27 ℃ 下培 養(yǎng) 7 天。在發(fā)酵過程中需補(bǔ)入苯乙酸前體及適量的培養(yǎng)基。 ② 提取精制：將青霉素發(fā)酵液冷卻，過濾。濾液在 pH2～ 的條件下，于萃取機(jī)內(nèi)用醋酸丁酯進(jìn)行多級(jí)逆流萃取，得到丁酯萃取液，轉(zhuǎn)入 ～ 的緩沖液中，然后再轉(zhuǎn)入丁酯中，將此丁酯萃取液經(jīng)活性炭脫色，加入成鹽劑，經(jīng)共沸蒸餾即可得青霉素 G 鉀鹽。青霉素 G鈉鹽是將青霉素 G鉀鹽通過離子交換樹脂（鈉型）而制得。 半合成青霉素的生產(chǎn)方法 以 6APA 為中間體與多種化學(xué)合成有機(jī)酸進(jìn)行?；磻?yīng)，可制得各種類型的半合成青霉素。 6APA 是利用微生物產(chǎn)生的青霉素?；噶呀馇?霉素 G 或 V而得到。酶反應(yīng)一般在40～ 50 ℃、 pH8～ 10 的條件下進(jìn)行；近年來，酶固相化技術(shù)已應(yīng)用于 6APA 生產(chǎn)，簡化了裂解工藝過程。 6APA 也可從青霉素 G 用化學(xué)法來裂解制得，但成本較高。側(cè)鏈的引入系將相應(yīng)的有機(jī)酸先用氯化劑制成酰氯，然后根據(jù)酰氯的穩(wěn)定性在水或有機(jī)溶劑中，以無機(jī)或有機(jī)堿為縮合劑，與 6APA 進(jìn)行酰化反應(yīng)。縮合反應(yīng)也可以在裂解液中直接進(jìn)行而不需分離出 6APA。 因產(chǎn)天然青霉素法生產(chǎn)工藝較半合成青霉素法簡單，而且采用發(fā)酵罐培養(yǎng)，每批次生產(chǎn)效率高，而半合成法對(duì)工藝要求較高，且中間物質(zhì)較多，可能存在 生產(chǎn)中中間體轉(zhuǎn)化不完等因素，而且成本較高，所以本設(shè)計(jì)采用天然青霉素的生產(chǎn)方法。 常見發(fā)酵方式 根據(jù)操作方式的不同，發(fā)酵過程主要有分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵三種類型。 四川理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) 8 分批發(fā)酵 營養(yǎng)物和菌種一次加人進(jìn)行培養(yǎng)，直到結(jié)束放出，中間除了空氣進(jìn)人和尾氣排出，與外部沒有物料交換。傳統(tǒng)的生物產(chǎn)品發(fā)酵多用此過程，它除了控制溫度和 pH 及通氣以外，不進(jìn)行任何其他控制，操作簡單。但從細(xì)胞所處的環(huán)境來看，則明顯改變，發(fā)酵初期營養(yǎng)物過多可能抑制微生物的生長，而發(fā)酵的中后期可能又因?yàn)闋I養(yǎng)物減少而降低培養(yǎng)效率，從 細(xì)胞的增殖來說，初期細(xì)胞濃度低，增長慢，后期細(xì)胞濃度雖高，但營養(yǎng)物濃度過低也長不快，總的生產(chǎn)能力不是很高。 其優(yōu)點(diǎn)是：①對(duì)溫度的要求低，工藝操作簡單；②比較容易解決雜菌污染和菌種退化等問題；③對(duì)營養(yǎng)物的利用效率較高，產(chǎn)物濃度也比 連續(xù)發(fā)酵 要高。缺點(diǎn)是：①人力、物力、動(dòng)力消耗較大；②生產(chǎn)周期較短，由于分批發(fā)酵時(shí)菌體有一定的生長規(guī)律，都 要經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期，而且每批發(fā)酵都要經(jīng)菌種擴(kuò)大發(fā)酵、設(shè)備沖洗、滅菌等階段； ③生產(chǎn)效率低，生產(chǎn)上常以體積生產(chǎn)率（以每小時(shí)每升發(fā)酵物中代謝產(chǎn)物的 g 數(shù)來表示）來計(jì)算效率，在分批發(fā)酵過程中，必須計(jì)算全過程的生產(chǎn)率，即時(shí)間不僅包括發(fā)酵時(shí)間，而且也包括放料、洗罐、加料、滅菌等時(shí)間。 連續(xù)發(fā)酵 所謂連續(xù)發(fā)酵，是指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可以有效地延長分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)期。在穩(wěn)定的狀態(tài)下，微生物 所處的環(huán)境條件，如營養(yǎng)物濃度、產(chǎn)物濃度、 pH 值等都能保持恒定，微生物細(xì)胞的濃度及其比生長速率也可維持不變，甚至還可以根據(jù)需要來調(diào)節(jié)生長速度。連續(xù)發(fā)酵具有以下優(yōu)點(diǎn)： ①可以維持穩(wěn)定的操作條件，有利于微生物的生長代謝，從而使產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量也相應(yīng)保持穩(wěn)定；②能夠更有效地實(shí)現(xiàn)機(jī)械化和自動(dòng)化，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減少操作人員與病原微生物和毒性產(chǎn)物接觸的機(jī)會(huì)；③減少設(shè)備清洗。準(zhǔn)備和滅菌等非生產(chǎn)占用時(shí)間，第二章 工藝設(shè)計(jì) 9 提高設(shè)備利用率，節(jié)省勞動(dòng)力和工時(shí)；④由于滅菌次數(shù)減少，使測(cè)量儀器探頭的壽命得 以延 長，節(jié)約了成本；⑤容易對(duì)過程進(jìn)行優(yōu)化控制， 有效地提高發(fā)酵產(chǎn)率。 當(dāng)然，他也存在一些缺點(diǎn) : ①由于是開放系統(tǒng)，加上發(fā)酵周期長，容易造成雜菌污染；②在長周期連續(xù)發(fā)酵中，微生物容易發(fā)生變異；③對(duì)設(shè)備、儀器及控制元器件的技術(shù)要求較高；④粘性絲狀菌菌體容易附著在器壁上生長和在發(fā)酵液內(nèi)結(jié)團(tuán)，給連續(xù)發(fā)酵 操作帶來困難。由于上述情況，連續(xù)發(fā)酵目前主要用于研究工作中，如發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，過程條件的優(yōu)化試驗(yàn)等等，而在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用還不多。連續(xù)培養(yǎng)方法可用于面包酵母和飼料酵母的生產(chǎn)，以及有機(jī)廢水的活性污泥處理。而新近發(fā)展的一種培養(yǎng)方法則是把固定化細(xì)胞技術(shù)和連續(xù)培養(yǎng) 方法結(jié)合起來，用于生產(chǎn)丙酮、丁醇、正丁醇、異丙醇等重要工業(yè)溶劑。 補(bǔ)料分批發(fā)酵 補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱 流加發(fā)酵， 半連續(xù)發(fā)酵，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)，是指在微生物分批發(fā)酵中，以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加一定物料的培養(yǎng)技術(shù)。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)充物料，可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時(shí)間地保持在一定范圍內(nèi)，既保證微生物的生長需要，又不造成不利影響，從而達(dá)到提高產(chǎn)率的目的。 如今， 流加發(fā)酵 的應(yīng)用范圍已相當(dāng)廣泛，包括 單細(xì)胞蛋白