【文章內(nèi)容簡介】 一些工作 ， 但研究進(jìn)展緩慢 。 近 10多年來 ,隨著微生物學(xué)的發(fā)展 ， 中外的專家學(xué) 者對紅曲色素進(jìn)行了大量廣泛而深入的研究 ， 在紅曲色素分離、結(jié)構(gòu)鑒定及改性、生成機(jī)制、菌種改良、液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化、代謝產(chǎn)物基因調(diào)控、功能性及安全性等理論和應(yīng)用方面的研究都卓有成效 ， 不斷拓展著紅曲色素的應(yīng)用領(lǐng)域 [17]。 20世紀(jì) 90年代以來國內(nèi)外在紅曲色素的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方面做了大量工作 ， 研究已取得突破性進(jìn)展。液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲色素 ,主要成分是水溶性的“復(fù)合色素”。采用這種生產(chǎn)方式具有周期短、產(chǎn)量高、雜質(zhì)少、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn) ， 有助于實現(xiàn)生產(chǎn)自動化 ， 提高產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性 ,擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的紅曲色素色價 偏低 ， 這是制約其工業(yè)化生產(chǎn)的重要原因之一 ， 為此 ， 國內(nèi)外廣泛開展了液態(tài)發(fā)酵菌種改良和工藝條件優(yōu)化的研究。目前 ， 提高紅曲色素色價的途徑主要有 : 提高紅曲菌的生物量、添加促進(jìn)色素形成的物質(zhì)等 ， 具體措施有 ： 菌種誘變、固定化細(xì)胞技術(shù) 、 葡萄糖流加培養(yǎng)、菌種聯(lián)合培養(yǎng)、添加抗氧化劑和金屬離子、添加植物油、青霉素以及使用超聲波處理等。另外 ， 紅曲色素發(fā)酵生產(chǎn)中使用的原料多以大米或飴糖、葡萄糖、淀粉、大豆蛋白粉等為主 ， 導(dǎo)致糧食消耗量大或生產(chǎn)的綜合成本較高 ， 目前國內(nèi)外已開發(fā)利用馬鈴薯、玉米、小米等為主要原料進(jìn)行生產(chǎn)的研究 [18]。 Silvana等 [19]以葡萄皮籽為原料 ， 研究確定了液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的工藝條件。由此可見 ， 以農(nóng)業(yè)工業(yè)廢棄物為原料生產(chǎn)紅曲色素有很中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 4 頁 共 25 頁 大的潛力 ， 這將是紅曲色素生產(chǎn)的發(fā)展方向之一。 本課題的意義 紅曲色素是紅曲在菌體生長代謝過程中產(chǎn)生的天然色素 ， 與其它天然色素相比 ， 具有熱穩(wěn)定性好 ， 蛋白著色力強(qiáng) ， 色調(diào)柔和 ， 對酸堿穩(wěn)定 ， 還可以提高加工制品對光和氧穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。而且紅曲色素?zé)o毒性、無致突變作用 ， 安全性很高。另外 ， 研究發(fā)現(xiàn)紅曲色素是多種色素成分的混合物 ， 從紅色紅曲霉產(chǎn)生的色素中還可分離提純出兩種新的紅曲色素。因此 紅曲可提供性能穩(wěn)定、安全性高、品種多樣的天然色素。紅曲色素符合食品著色劑“天然、營養(yǎng)、多功能”的發(fā)展方向 ， 具有很好的應(yīng)用前景。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 5 頁 共 25 頁 2 紅曲霉菌種的選育 紅曲色素 生產(chǎn)菌 本設(shè)計以從土壤中篩選得到的紅曲霉菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和超聲波復(fù)合誘變，篩選得到了得到高產(chǎn)紅曲色素的菌株。 菌種描述 紅曲霉 在 麥芽 汁瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，菌落初為白色，老熟后變成 淡粉色、紫色或灰黑色。 紅曲霉 菌絲體 的 大量分枝的頂端產(chǎn)生單個或成串的 分生孢子 ， 孢子 呈球形或橢圓形 ， 閉囊殼橙紅色，近球形，含有多數(shù)子囊， 子囊 內(nèi)含 8個孢子， 子囊孢子 卵形或近球形，光滑，透明，無色或漆紅色 。 紅曲霉能在 15~45℃ 生長 ，最適 生長 溫度為 32~35℃ ，最適 生長 pH為 ~，有良好的耐酸和耐乙醇能力。能利用淀粉、糊精、麥芽糖、蜜二糖、纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、蘋果酸、檸檬酸等多種糖類和酸類作為碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有機(jī)氮。紅曲霉能自身合成生物素、硫胺素、核黃素、麥角固醇等多種維生素。紅曲霉可代謝生成多種酶類，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。 色價分析方法 液態(tài)發(fā)酵樣品用濾紙過濾得濾液和濾渣，濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用 721型分光光度計于510 nm處測定 OD值，濾渣用蒸餾水洗滌 3次后于 60℃ 烘干稱重測得生物量，然后稱取 1g干菌絲用 75%的乙醇浸提 2次，每次 2h，過濾，合并后的濾液適當(dāng)稀釋后用 721型分光光度計于 510 nm處測定 OD值。色價 =稀釋倍數(shù) OD值。 誘變選育 選育過程： 復(fù)合誘變流程：出發(fā)菌株→超聲波誘變→平板分離→紫外誘變→平板分離→穩(wěn)定性試驗→對比試驗 孢子懸浮液的制備： 菌株在 33℃ 斜面培養(yǎng) 4d后，用無菌生理鹽水洗下紅曲霉孢子，倒入 已滅菌的裝有 20~30顆玻璃珠的三角瓶中，放入搖床中 220r/min 振蕩 1h，孢子分散均勻即可。用 4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成孢子懸浮液，濃度稀釋至 l06個 /mL，以備用。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 6 頁 共 25 頁 復(fù)合誘變 （ 1） 超聲波誘變： 將 9支裝有菌懸液的試管放入超聲波清洗儀的工作箱內(nèi)，調(diào)整超聲波功率為 500w ，分別作用 5min~45min后，取出試管即刻放到冰水中冷卻，防止超聲波產(chǎn)熱殺死孢子。將所得孢子懸液稀釋 l06倍涂布， 32℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3d后觀測、計數(shù)，對誘變后的菌株進(jìn)行篩選。 （ 2） 紫外誘變：將經(jīng) 超聲波 誘變篩選好 的菌株進(jìn)行孢子懸浮液的配制，取濃度為 106個 /mL紅曲霉孢子懸浮液 5mL，加入直徑 90mm的無菌培養(yǎng)皿中，先預(yù)熱紫外燈 30min，然后開啟平皿蓋于磁力攪拌下分別處理 1min、 、 2min、 、 3min、 4min（ 15W， 30cm），然后稀釋至 l05倍，分別吸取 3個稀釋度的孢子懸浮液各，培養(yǎng) 3d~4d后，計算致死率（紫外誘變致死的孢子數(shù)與未經(jīng)誘變總孢子數(shù)的比值）和正突變率（菌落直徑與擴(kuò)散圈直徑比值比未經(jīng)誘變的菌落直徑與擴(kuò)散圈直徑比值小的為正突變的 菌落，正突變的菌株與總菌株個數(shù)的比值稱正突變）。以致死率70%~80%、正突變率最高為最適突變劑量，以最佳劑量處理孢子懸浮液，涂布平板，挑去單菌落進(jìn)行搖瓶篩選 [23]。 搖瓶篩選 （ 1）小瓶發(fā)酵初篩：斜面培養(yǎng) 5d~7d，待孢子成熟，接種于裝有 20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中， 220r/min、 32℃培養(yǎng) 96 h。重復(fù)接種 3瓶。根據(jù)生物量高的 5~8株用于復(fù)篩和菌種保藏。 （ 2）大瓶復(fù)發(fā)酵復(fù)篩：用初篩出的 5~8株菌的成熟斜面孢子接種于裝有 80mL種子培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中， 220r/min， 32℃培養(yǎng) 48h，得種子液。取種子液 8mL~10mL接種于裝有 80mL~100mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中， 220r/min、 32℃培養(yǎng) 96h。根據(jù)提 取紅曲色素 產(chǎn)量高篩選出 1~2株用于下一輪誘變處理 [22]。 穩(wěn)定性試驗 將誘變后的菌株傳代 10次，每代都進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，產(chǎn)量穩(wěn)定的則其性能可能穩(wěn)定。 菌種保藏 其原理是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子和菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。 菌種保藏的方法有：斜面冰箱保藏法、 砂 土管保藏法、菌絲速凍法 、石蠟油封存法、中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 7 頁 共 25 頁 真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法。對于 紅曲霉 采用斜面冰箱保藏法。 3 培養(yǎng)基 紅曲霉 的培養(yǎng)基 A：斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉 3%，葡萄糖 6%，蛋白胨 2%，瓊脂 3%，自來水，乳酸調(diào)節(jié) pH值至 ， 121℃ 高壓滅菌 30 min。 B： 種子培養(yǎng)基：早秈稻米粉 3%， NaNO3 %， KH2P04 %， MgS04 %，自來水，乳酸調(diào)節(jié) pH值至 ~， 121℃ 高壓滅菌 30 min。 C： 基本發(fā)酵培養(yǎng)基 ： 大米粉 9%， 葡萄糖 7%， 蛋白胨 2%， NaNO3 %， KH2P04 %，MgS04 %， pH ~， 121℃ 高壓滅菌 30 min。 D： 補(bǔ)料培養(yǎng)基： 補(bǔ)料 1： 25%~28%氨水，使 pH保持在設(shè)定范圍內(nèi)。 補(bǔ)料 2： 80%磷酸，使 pH保持在設(shè)定范圍內(nèi)。 補(bǔ)料 3：葡萄糖 20%，蛋白胨 2%， NaNO3 %， KH2P04 %， MgS04 %， pH ~。 培養(yǎng)基的設(shè)計 碳源 碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的組分之一，是微生物代謝的能量來源。葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源時，最終所得的紅曲色素色階高于蔗糖、麥芽糖和 大米粉為碳源下的。但是因為大米粉市場價格明顯低于葡萄糖價格，兩者差距不大，因此，宜選用大米粉作為紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。 在紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的發(fā)酵過程中，由于碳源的補(bǔ)加促進(jìn)了菌體的生長，從而促進(jìn)了紅曲色素色階的提高。值得注意的是，盡管補(bǔ)加蔗糖所得的菌體量顯著高于補(bǔ)加葡萄糖方案條件下的菌體量，但是其紅曲色素色階卻顯著低于補(bǔ)加葡萄糖的方案。雖然補(bǔ)加麥芽糖得到的紅曲色素色階高于補(bǔ)加葡萄糖的方案，但是二者之問無差異顯著性。綜合原料成本，宜選用葡萄糖作為紅曲霉最佳的補(bǔ)加碳源。 氮源 氮源是構(gòu)成細(xì)胞中所含 蛋白質(zhì)、核酸、酶等成分，以及代謝產(chǎn)物中氮素來源的營養(yǎng)物質(zhì)，所有紅曲霉在生長時均可利用無機(jī)氮源。工業(yè)生產(chǎn)中通常使用的氮源有氨、銨鹽中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 8 頁 共 25 頁 和尿素。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源不足時，可作為補(bǔ)充碳源。常用的氮源有有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩大類。黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉、魚粉、菌絲體和酒糟等都是有機(jī)氮源。無機(jī)氮源有氨水、硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽等。 氮是構(gòu)成微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素，因此是菌體生長以及代謝產(chǎn)物形成所必需的。為探索出紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中的最佳氮源，選用蛋白胨作為氮源，其對應(yīng)的紅曲色素色階顯著高于 其它氮源下所得的紅曲色素色階。但蛋白胨市場價格高于硝酸鈉等氮源物質(zhì)，用硝酸鈉替代后結(jié)果差異不是很大， 因此選用硝酸鈉作為紅曲霉發(fā)酵的氮源。 無機(jī)鹽及微量元素 無機(jī)鹽類是微生物必不可少的一類物質(zhì)，它們?yōu)槲⑸锏恼４x提供多種重要的生理功能。硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸錳等無機(jī)鹽類對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的測定結(jié)果，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸二氫鉀，硫酸鎂時所得的紅曲色素色階顯著高于不添加任何無機(jī)鹽類的試驗方案。因此，磷酸二氫鉀，硫酸鎂對紅曲色素的合成具有顯著的促進(jìn)作用。 中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 9 頁 共 25 頁 4 滅菌 所 謂滅菌，是指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過程。應(yīng)用的范圍有： （ 1） 培養(yǎng)基滅菌； （ 2） 氣體滅菌； （ 3） 設(shè)備及管道滅菌等。 常用的滅菌方法有以下幾種： a、化學(xué)滅菌； b、射線滅菌； c、干熱滅菌； d、濕熱滅菌； e、過濾滅菌。 化學(xué)滅菌：由于化學(xué)藥劑會與培養(yǎng)基中的一些成分作用，而且加入培養(yǎng)基后不易去除，所以化學(xué)滅菌不用于培養(yǎng)基的滅菌。但染菌后的培養(yǎng)基可以用化學(xué)藥劑處理。 射線滅菌：紫外線的穿透力低，所以僅用于表面消毒和空氣的消毒。 濕熱滅菌： 滅菌原理是直接用蒸汽滅菌，蒸汽在冷凝時能釋放出大量 潛熱 ， 蒸汽具有強(qiáng)大的穿透力，破壞菌體蛋白和核酸的化學(xué)鍵，使酶失活，微生物因代謝障礙而死亡。水煮常壓滅菌： 100℃ ?；蝻柡驼羝麥缇阂话?121℃ ， 30 分鐘。適合培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌。 干熱滅菌： 滅菌原理是利用高溫對微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。常用灼燒和電熱箱加熱， 140~180℃、 1~2小時。適于對玻璃及金屬用具及沙土管滅菌。 過濾除菌： 除菌原理是利用微生物不能透過濾膜除菌。方法是使用 ~ mm孔徑濾膜，用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。 儀器滅菌 在發(fā)酵操作過程中，種子活化、擴(kuò)大培養(yǎng)需要接種環(huán)、搖瓶、試管等儀器。接種環(huán)應(yīng)用火焰灼燒法滅菌；搖瓶、試管應(yīng)用蒸煮法滅菌。經(jīng)過滅菌 的 儀器不要暴露于空氣中或于其它的未知儀器接觸，并及時使用，以免再次帶菌。 培養(yǎng)基滅菌 對于培養(yǎng)基滅菌大多采用濕熱滅菌，即利用飽和水蒸氣有很強(qiáng)的穿透力，而且在冷凝時放出大量冷凝熱，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺滅各種微生物。同時蒸汽 的價格低廉，來源方便，滅菌效果可靠，所以培養(yǎng)基滅菌，發(fā)酵設(shè)備及管道的滅菌，試驗用材料的滅菌，普遍采用這種滅菌方法。通常的蒸汽滅菌條件是在 121℃ （表壓約 ）維持 30min。 分批滅菌 是將先配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一中北大學(xué) 20xx 屆畢業(yè)設(shè)計說明書 第 10 頁 共 25 頁 起滅菌的操作過程（適用于小型發(fā)酵罐）。 連續(xù)滅菌 連續(xù)滅菌也叫連消，就是將將配制好的并經(jīng)預(yù)熱的 培養(yǎng)基 用泵連續(xù)輸入由直接蒸汽加熱的加熱塔，使其在短時間內(nèi)達(dá)到滅菌溫度（ 126~132℃ ）。然后進(jìn)入維持罐（或維持管），使在滅菌溫度下維持 5~7 分鐘后再進(jìn)入冷卻管，使其冷卻至接種溫度 并直接進(jìn)入已事先滅菌（空罐滅菌）過的 發(fā)酵罐 內(nèi)。其過程均包括加熱、維持和冷卻等滅菌操作過程。 連續(xù)滅菌的 連續(xù)性強(qiáng)，快速