【文章內(nèi)容簡介】 于 的時候 ,比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比 ,當比生長速率高于 ,比生產(chǎn)速率與比生長速率無關 D因此 ,要在發(fā)酵過程中達到并維持最大比生產(chǎn)速率 ,必須使比生長速率不低 。這一比生長速率稱為臨界比生長速率。對于分批補料發(fā)酵的生產(chǎn)階段 來說 ,維持 的臨界比生長速率意味著每 46h 就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍 ,這在實際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實現(xiàn)的。事實上 ,青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多 ,卻仍然能達到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶 ,抵消了一部分生長 ,故雖然表觀比生長速率低 ,但真比生長速率卻要高一些。 菌絲形態(tài) 在長期的菌株改良中 ,青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸 ,故一般比生產(chǎn)速率較高 。后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低 ,使氣 液兩相間氧的傳遞速率大大提高 ,從而允許更多的菌絲生長 即臨界菌體濃度較高 ,發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。 在絲狀菌發(fā)酵中 , 控制菌絲形態(tài)使其保持適當?shù)姆种Ш烷L度 ,并避免結球 ,是獲得高產(chǎn)的關鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中 ,使菌絲球保持適當大小和松緊 ,并盡量減少游離菌絲的含量 ,也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關。 工藝控制要點 種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上 ,25176。 C 培養(yǎng) 7 天 ,真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆谩Ｉa(chǎn)時它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi) ,26 176。C培養(yǎng) 56h左右 ,菌絲濃度達 6%8%,菌絲形態(tài)正常 ,按 10%15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內(nèi) ,27176。 C 培養(yǎng) 24h,菌絲體積 10%12%,形態(tài)正常 ,效價在 700D/ml 左右便可作為發(fā)酵種子。 球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有 %%玉米漿的三角瓶培養(yǎng)原始親米孢子 ,然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子又稱生產(chǎn)米 ,親米和生產(chǎn)米均為 25176。 C靜置培養(yǎng) ,需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 34天 ,大米表面長出明顯小集落時要振搖均勻 ,使菌絲在大米表面能均勻生長 ,待 10 天左右形成綠色孢子即可收獲。親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置恒溫培養(yǎng) ,生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米 300 萬只以上。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5176。C 冰箱內(nèi)。 工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米指收獲后的孢瓶在 10 天以內(nèi)使用接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi) ,28176。 C 培養(yǎng) 5060h 當 pH值由 下降至 ,菌絲呈菊花團狀 ,平均直徑在 100130μ m,每毫升的球數(shù)為 6 萬 8 萬只 ,沉降率在 85%以上 ,即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在800011000 只 /mL 范圍的要求 ,計算移種體積 ,然后接入發(fā)酵罐 ,多余的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳 ,其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子 ,能使青霉素發(fā)酵單位的罐批差異減少。 培養(yǎng)基成分的控制 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 DE 值 50%以上進行流加。 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮 ,并補加無機氮源 (硫酸氨、氨水或尿素 )。 生物合成含有芐基基團的青霉素 G,需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺 ,一次加入量不大于 %,并采用多次加入 ,以防止前體對青霉素的毒害。 加入的無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等 ,且用量要適度。另外 ,由于鐵離子對青霉菌有毒害作用 ,必須嚴格控制鐵離子的濃度 ,一般控制在30 μ g/mL 發(fā)酵培養(yǎng)的控制 1 加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定 ,最好是根據(jù)排氣中 CO2 量及 O2 量來控制 ,一般在殘?zhí)墙抵?%左右 ,pH 值上升時開始加糖。 2 補氮及加前體 補氮是指加硫酸銨、氨水或尿素 ,使發(fā)酵液氨氮控制在%%,補前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 %%。 3pH 值控制 對 pH 值的要求視不同菌種而異 ,一般為 ,可以補加葡萄糖來控制。目前一般采用加酸或加堿控制 pH 值 4 溫度控制 前期 25176。 C 26176。 C,后期 23176。 C,以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。 5 溶解氧的控 制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的 30%。通風比一般為 1:,攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應根據(jù)需要而調(diào)整。 6 泡沫的控制 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫 ,可以用天然油脂 ,如豆油、玉米油等或用化學合成消泡劑 泡敵 來消泡 ,應當控制其用量并要少量多次加入 ,尤其在發(fā)酵前期不宜多用 ,否則會影響菌體的呼吸代謝 7 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 ,用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵 ,生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 。根據(jù) 鏡檢 中菌絲形變化和代謝變化的其他指標調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度 ,通過追加糖或補 加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間 ,以獲得最多青霉素。當菌絲中空泡擴大、增多及延伸 ,并出現(xiàn)個別自溶細胞 ,這表示菌絲趨向衰老 ,青霉素分泌逐漸停止 ,菌絲形態(tài)上即將進入自溶期 ,在此時期由于茵絲自溶 ,游離氨釋放 ,pH 值上升 ,導致青霉素產(chǎn)量下降 ,使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多 ,并使發(fā)酵液變稠 ,增加下一步提純時過濾的困難。因此 ,生產(chǎn)上根據(jù) 鏡檢 判斷 ,在自溶期即將來臨之際 ,迅速停止發(fā)酵 ,立刻放罐 ,將發(fā)酵液迅速送往提煉工段。 4 工藝計算 表 1 工藝計算基礎數(shù)據(jù) 年產(chǎn)量 10000t 發(fā)酵單位 80000μ /ml 發(fā) 酵周期 180h 成品效率 1000μ /mg 年工作日 320 天 發(fā)酵罐裝料系數(shù) 輔助時間 12h 種子罐裝料系數(shù) 消后大罐接種量 15% 種子罐發(fā)酵周期 60h 消后中罐接種量 8% 發(fā)酵期間補葡萄糖量 (m3?h) 物料衡算 發(fā)酵周期 180h,輔助時間 12h,則產(chǎn)一批青霉素需要 8 天。每年共有 : 每周期產(chǎn)量為 :10000247。 40250t 。 先選擇大罐 500 m3 發(fā)酵罐 ,則每個罐裝青霉素料 500 m3。 則每個發(fā)酵罐裝料量為 : m3106ml80000μ/ml247。 1000μ/mg 。 則需要的罐體為 250247。 則此設計中選擇八個 500m3 的發(fā)酵罐來發(fā)酵罐。 再選擇二級種子罐 ,接種量為 15%,在一個周期內(nèi) ,需要中罐裝料液體積 : V8500%15% m3 則需要的罐體大小為 :V 中 247。 %600 m3 。 則二級種子罐可選擇 100 m3 的六個。 二級種子罐接種量為 9%,所需種子罐裝料為 8% m3 所需一級種子罐大小為 V 種子 247。 65% m3。 可以選擇三個體積為 20 m3 的一級種子罐。 在整個發(fā)酵周期中 ,只考慮葡萄糖、硫酸銨、苯乙酸、消泡劑、氨水等的體積。 a 發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/l) 表 2 發(fā)酵培養(yǎng)基用量 葡萄糖 10 K2HPO4 玉米漿 40 MgSO4?7H2O 35 NH42SO4 KH2PO4 則 (1)葡萄糖 : 每周期消耗量 :375 103750kg 每年消耗量 :3750 40150000kg150t。 (2)玉米漿 : 每周期消耗量 :375 4015000kg 每年消耗量 :15000 40600000kg600t。 (3)NH42SO4: 每周期消耗量 :375 每年消耗量 : 4085050kg。 (4)K2HPO4: 每周期消耗量 :375