4基因工程操作技術(shù)(編輯修改稿)
2025-03-23 10:47 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 對(duì)離子強(qiáng)度要求相同的酶，可同時(shí)酶解。 對(duì)離子強(qiáng)度要求不同的酶： – 低鹽濃度的酶先切，后補(bǔ)加NaCl – 一種酶切后，沉淀 DNA，換緩沖液。 Ligation: the final step in construction of a rebinant DNA molecule. 3 連接 The different joining reactions catalysed by DNA lligase. 外源 DNA與載體 DNA的連接 相同粘性末端的連接 平頭末端的連接 不同粘性末端的連接 人工粘性末端的連接 粘性末端的更換 相同粘性末端的連接 來(lái)源 – 相同的酶 – 同尾酶 問(wèn)題 – 極性有兩種可能 – 同尾酶連接后，不能用任何一種酶酶切。稱為?焊死?。 同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 539。 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 539。 G CTTAA AATTC G 539。 539。 G CTTAA 539。 539。 AATTC G 539。 退火 G CTTAA AATTC G 539。 G CTTAA 539。 AATTC G G CTTAA AATTC G 539。 G CTTAA 539。 AATTC G T4DNA ligase GAATTC CTTAAG 539。 539。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 539。 539。 GAATTC CTTAAG 同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 退火 G CCTAG GATCC G 539。 T ACTAG 539。 GATCA T 539。 539。 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 539。 TGATCA ACTAGT 539。 BamHI 539。 G CCTAG GATCC G 539。 539。 T ACTAG 539。 539。 GATCA T 539。 BclI G CCTAG GATCC G 539。 T ACTAG 539。 GATCA T T4DNA ligase TGATCC ACTAGG 539。 539。 GGATCA CCTAGT TGATCC ACTAGG 539。 539。 GGATCA CCTAGT 不同酶的相同粘性末端的連接 退火 G CCTAG AATTC G 539。 G CTTAA 539。 GATCC G 539。 GAATTC CTTAAG GATCC G 539。 539。 G CTTAA 539。 EcoRI BamHI BamHI 539。 539。 GGATCC CCTAGG 539。 G CCTAG AATTC G 539。 EcoRI T4DNA ligase G CCTAG AATTC G 539。 G CTTAA 539。 GATCC G 平頭末端的連接 粘性末端 分子內(nèi)部連接，平頭末端 分子間的連接。 提高連接效率的方法： – 加大酶用量（ 10倍） – 加大平頭末端底物的濃度 – 加入 10%PEG（ 8000），促進(jìn)分子間的有效作用 – 加入單價(jià)陽(yáng)離子， 150200mM NaCl – 提高反應(yīng)溫度 平頭連接同樣存在兩種極性 不同粘性末端的連接 突出 539。末端 – Klenow補(bǔ)平，或 S1核酸酶切平，然后平頭連接 突出 339。末端 – T4DNApol切平，然后平頭連接 突出末端不同 – Klenow補(bǔ)平，或 S1核酸酶切平 連接后，可能恢復(fù)限制性位點(diǎn)，甚至還可能產(chǎn)生新的位點(diǎn)。 XbaI與 HindIII（ XbaI恢復(fù)）， XbaI與 EcoRI（均保留）， BamHI與 Bgl II（產(chǎn)生 ClaI位點(diǎn)） 不同粘性末端的連接 T4DNA ligase CGATCC GCTAGG 539。 539。 GGATCG CCTAGC 539。 539。 GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG 539。 CTGCAG GACGTC 539。 BamHI PstI 539。 G CCTAG GATCC G 539。 539。 CTGCA G 539。 G ACGTC 339。 339。 T4
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