redet同源重組技術概述(編輯修改稿)
2025-03-17 16:53 本頁面
【文章內容簡介】 催化與互補 ssDNA之間的退火。 3. RecA ４個亞基 形成有活性的 RecA蛋白，細菌中廣泛存在且高度保守，有同源重組酶、 DNA損傷修復、 DNA依賴 ATPase活性等功能。 可誘導 SOS反應、挽救 DNA復制叉等， 提高電擊后細胞的活力，增加電轉化效率 。 五、 Red/ET重組操作流程 引物設計合成 線性供體 dsDNA底物的制備 線性載體的制備 重組反應 重組產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞 重組子篩選 重組子檢測 1. 設計合成引物 設計引物時要遵循 一般 引物設計的基本原則， 但是 上下游引物要加上 1520bp的載體同源序列。載體同源序列如何添加主要分以下兩種情況： （ 1）載體酶切后是 5’端突出或平末端，則引物上的同源序列包括 5’端突出序列的同源序列。 （ 2）載體酶切后是 3’端突出，則引物上的同源序列不包括 3’端突出序列的同源序列。 引物設計方法 同源臂長度對 Red/ET重組效率的影響（數(shù)據(jù)來自 Zhang et al. 1998） 同源臂的長度在 15～ 50bp時， 重組效率就能滿足實驗要求，重組效率隨著同源臂長度的增加而增加。 2. 線性供體 dsDNA底物的制備 ? 選用保真度高的 DNA聚合酶 （如 Phusion、 Pyrobest等，減少PCR反應中的突變；擴增 GC含量較高的 DNA片段時，選用 Triplemaster、HotStarTaq 等）， 用合成的引物 PCR擴增獲得 dsDNA底物； ? 純化 PCR產(chǎn)物： （ 1）減少模板背景對篩選工作帶來的難度； （ 2）降低其剩余引物與靶標 DNA片段的結合，提高重組效率； （ 3）去處 PCR產(chǎn)物中的鹽離子，提高轉化效率。 ? 降低模板對篩選工作帶來的難度； （ 1）純化回收 PCR產(chǎn)物； （ 2）內切酶消化處理模板； （ 3）使用 R6K復制子。 線性化載體可以通過 酶切 或 PCR擴增 兩種方法獲得。 1）酶切 選取合適的位點，單酶切或雙酶切皆可 ,質粒的線性化不徹底，將導致陰性克隆的產(chǎn)生，為了提高陽性率，建議通過雙酶切進行質粒線性化。 2） PCR擴增 選取合適的位點，設計正向和反向引物，引物長度一般在 1820bp左右，建議用高保真的聚合酶擴增。為了避免模板質粒 DNA對后續(xù)試驗的影響，建議用 Dpn I內切酶消化 PCR產(chǎn)物，降低背景，提高陽性率。 不管采取哪種方法，最終線性化載體的濃度需 50ng/ul，高濃度的載體有利于提高效率。 3. 線性載體的制備 4. 同源重組反應 試劑 加量 10x Buffer 1ul Rebination Enzyme 1ul
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