【文章內(nèi)容簡介】 v消泡油添加過量v微生物生長過程中形成了生理酸性物質(zhì)引起 pH下降的因素v氮源過多v微生物生長過程中形成了生理堿性物質(zhì)v中間補(bǔ)料，堿性物質(zhì)添加過多引起 pH上升的因素252。原則：有利于菌體生長和產(chǎn)物的合成。一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。252。最適 pH與菌株，培養(yǎng)基組成，發(fā)酵工藝有關(guān)。應(yīng)按發(fā)酵過程的不同階段分別控制不同的 pH范圍。（三）最適 pH的選擇252。 最適 pH與微生物生長，產(chǎn)物形成之間相互關(guān)系的四種類型：216。 菌體比生長速率 μ 和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率 QP的最適 pH在一個(gè)相似的較寬的范圍內(nèi)（比較容易控制）；216。 μ 較寬， Qp范圍較窄，或 μ 較窄， Qp范圍較寬（難控制，應(yīng)嚴(yán)格控制）；216。 μ 和 Qp對 pH都很敏感，其最適 pH相同（應(yīng)嚴(yán)格控制）；216。 更復(fù)雜， μ 和 Qp對 pH都很敏感，并有各自的最適 pH（ 難度最大）；v調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方v調(diào)節(jié)碳氮比（ C/N）v添加緩沖劑（如磷酸鹽）v補(bǔ)料控制– 直接加酸加堿– 補(bǔ)加碳源或氮源（氨水等）（四） pH值的控制方法n （一）發(fā)酵過程中對氧的需求n 大多數(shù)發(fā)酵過程是好氧的，因此需要供氧。如果考慮呼吸的化學(xué)計(jì)量，則葡萄糖的氧化可由下式表示： C6H 12O6 十 6O2＝ 6H2O十 6CO2 n 只有當(dāng) 這兩種反應(yīng)物 均溶于水 后，才對菌體有用。n 氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約 6000倍左右 (氧在水中的飽和度約為 l0mg/L 。 28?C時(shí)氧在發(fā)酵液中 100%的空氣飽和濃度只有 7mg/L )。n 許多發(fā)酵的生產(chǎn)能力受到氧利用限制，因此溶氧（ DO）成為影響發(fā)酵效率的重要因素。四、氧對發(fā)酵的影響（ p162167）基 質(zhì) 微生物 g氧 /g干菌體葡萄糖 大腸桿菌 甲 醇 假單孢菌 C 辛 烷 假單孢菌 生長于不同基質(zhì)上的不同微生物的需氧要求? 由于菌體的代謝是受發(fā)酵液中的溶氧（ DO）濃度的影響，故簡單地依據(jù)總需求來供氧是欠妥的，而影響溶解氧的因素有許多，如供氧、通氣攪拌、微生物的需氧情況等。? 如何判斷溶氧是否能夠滿足微生物的需求的有效方法是 就地檢測發(fā)酵液中溶氧的濃度 。? 常用的方法是在發(fā)酵罐中安裝溶氧電極。（二）微生物的臨界氧濃度（ C臨界）? 臨界氧濃度（ C臨界 ）：? 指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度，或微生物對發(fā)酵液中溶解氧濃度的最低要求。? 各種微生物的臨界氧值以空氣飽和度 % 來表示。? 不同微生物不同，同種微生物的呼吸臨界值不一定與產(chǎn)物合成臨界值相同?！?一些微生物的臨界氧濃度微 生 物 溫度（ ?C） 臨界氧濃度%細(xì) 菌 37 310酵 母 30 310放線菌 30 530青霉素 24 1015（三）溶氧對發(fā)酵的影響由此可知，只有使溶氧濃度高于其臨界值，才能維持菌體的最大比攝氧率，得到最大的菌體合成量。如果溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受到干擾。 但是，發(fā)酵工業(yè)的目標(biāo)是要得到菌體發(fā)酵的產(chǎn)物而不是菌體本身。因此，由氧饑餓而引起的細(xì)胞代謝干擾，可能對形成某些產(chǎn)物是有利的；同理，當(dāng)提供的氧濃度遠(yuǎn)大于臨界值時(shí)，雖對菌體形成無妨，但也許能刺激產(chǎn)物的形成；所以，某種產(chǎn)物形成的最佳條件 可能不同于 菌體生長的最佳通氣條件。 根據(jù)需氧不同，可將初級(jí)代謝發(fā)酵分為： （ p163） a. 供氧充足條件下，產(chǎn)量最大；若供氧不足，合成受強(qiáng)烈抑制。 如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等。 ，可得最高產(chǎn)量；若供氧受限，產(chǎn)量受影響不明顯。 如：異亮氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸等。 ，細(xì)胞呼吸受抑制時(shí)，才獲得最大量產(chǎn)物；若供氧充足，產(chǎn)物形成反而受抑制。 如：亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸等。由此可見，供氧大小與產(chǎn)物的合成途徑密切相關(guān)。? 但在實(shí)際生產(chǎn)過程中需注意兩種情況：– 溶解氧濃度過低（代謝異常，產(chǎn)量降低）– 溶解氧濃度過高（代謝異常，菌體提前自溶）■ 實(shí)例一在對黃色短桿菌 (Brevibacterium flavum)生物合成氨基酸進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶氧濃度對相關(guān)的氨基酸的生物合成具有很大的影響。研究表明：菌體的臨界溶氧濃度為 ；并根據(jù) “ 安全 ” 的程度予以考慮供氧的程度，也即把菌體的呼吸率作為最大呼吸率的一個(gè)組成部分。因此，氧安全值低于最大呼吸率就意味著其溶氧濃度低于臨界值。當(dāng)溶氧濃度低于 ，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響，但苯丙氨酸，纈氨酸和亮氨酸最佳合成的溶氧濃度分別為 、 。從合成途徑中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸來自于三羧酸循環(huán) (TCA)的中間體，而苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸來自于糖酵解的中間體，即來自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。? Feren和 Squires(1969)對頂頭孢霉產(chǎn)生頭孢菌素和卷曲霉素 (Capreomycin)的研究即是一個(gè)氧對次級(jí)代謝影響的例子。? 研究表明，頭孢菌素產(chǎn)生菌的臨界氧濃度在 0～ 7％的空氣飽和度間；而對卷曲霉素產(chǎn)生菌則為 13～ 23％。但就抑制抗生素生物合成的溶氧濃度來說，對頭孢菌素為低于 10～ 20％；而對卷曲霉素則為 8％。? 因此，在生產(chǎn)頭孢菌素時(shí)，應(yīng)使其溶氧濃度遠(yuǎn)大于臨界值，而在生產(chǎn)卷曲霉素時(shí)，則應(yīng)使其溶氧濃度低于臨界值。 ■ 實(shí)例二（四） 發(fā)酵過程的溶氧變化規(guī)律 （ p164）n發(fā)酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不斷大幅度增加，此時(shí) 需氧超過供氧 ，溶氧明顯下降 。n發(fā)酵中期，溶氧明顯受工藝控制手段的影響，如補(bǔ)料的數(shù)量、時(shí)機(jī)和方式等 。微生物需氧量仍然大，溶氧雖有波動(dòng)但變化不大，維持在一定水平。n發(fā)酵后期由于菌體衰老，呼吸減弱，溶氧濃度也會(huì)逐步上升，一旦菌體自溶，溶氧就會(huì)明顯地上升，甚至是直線上升。 發(fā)酵過程中溶氧的異常（ p164）? 溶氧的異常：? 發(fā)酵過程中溶氧明顯上升或下降的現(xiàn)象。? 溶氧下降出現(xiàn)的原因：? 污染好氣雜菌? 菌體代謝異常? 某些設(shè)備或工藝發(fā)生故障或變化。（五）溶氧的控制措施216。調(diào)節(jié)通風(fēng)與攪拌。216。限制基礎(chǔ)培養(yǎng)基的濃度，使發(fā)酵器內(nèi)的生物體濃度維持于適當(dāng)水平；并以補(bǔ)料方式供給某些營養(yǎng)成分而控制菌體生長率和呼吸率。216。改善發(fā)酵液的黏度 。五、發(fā)酵過程中的泡沫及其控制（ p168172）（一）泡沫的性質(zhì) 泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系。泡沫間被一層液膜隔開而彼此不相連通。發(fā)酵過程中所遇到的泡沫，其 分散相是無菌空氣和代謝氣體 ，連續(xù)相是發(fā)酵液。252。一類存在于發(fā)酵液的 液面上 。 這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡沫與它下面的液體之間有能分辮的界線。 如在某些稀薄的前期發(fā)酵液或種子培養(yǎng)液中所見到的。252。另一種泡沫是出現(xiàn)在粘稠的菌絲 發(fā)酵液中 。 這種泡沫分散很細(xì)，而且很均勻，也較穩(wěn)定。泡沫與液體間沒有明顯的波面界限，在鼓泡的發(fā)酵液中氣體分散相占的比例由下而上地逐漸增加。（二）泡沫的類型252。由外界引進(jìn)的氣流被機(jī)械地分散形成（通風(fēng)、攪拌）；252。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成（發(fā)泡性物質(zhì)）。（三）泡沫產(chǎn)生的原因v降低發(fā)酵設(shè)備的利用率v增加了菌群的非均一性v增加了染菌的機(jī)會(huì)v導(dǎo)致產(chǎn)物的損失v消泡劑會(huì)給后提取工序帶來困難（四）泡沫對發(fā)酵的不利影響v通氣與攪拌的強(qiáng)度v培養(yǎng)基的配比及原材料組成v培養(yǎng)基的破壞程度v接種量的大小v培養(yǎng)液本身性質(zhì)的變化v培養(yǎng)基滅菌的方法和操作v染菌（五）影響泡沫穩(wěn)定的因素不同攪拌速度和通氣量對泡沫影響不同濃度蛋白質(zhì)原科的起泡作用滅菌時(shí)間對泡沫穩(wěn)定性的影響 （六）發(fā)酵過程泡沫的變化發(fā)酵過程中泡沫的消長規(guī)律? （ 1）發(fā)酵初期，泡沫穩(wěn)定，其原因是發(fā)酵液的高表面粘度和低表面張力。? （ 2）發(fā)酵進(jìn)程中，表面粘度下降，表面張力上升，泡沫壽命縮短而減少，原因是微生物產(chǎn)生的胞外酶把造成泡沫穩(wěn)定的物質(zhì)如蛋白質(zhì)等逐步降低的結(jié)果。? （ 3）發(fā)酵后期，隨菌體的自溶，導(dǎo)致培養(yǎng)基中的可溶性蛋白質(zhì)的增加，又產(chǎn)生泡沫。 （七）發(fā)酵過程泡沫控制的方法? 物理消泡法? 化學(xué)消泡法? 使用時(shí)要注意：加入量及時(shí)機(jī)，一般要盡可能減少消泡劑的用量。在應(yīng)用前要做比較性試驗(yàn)，找在已知培養(yǎng)基中消泡劑對微生物生理特性影響最小，消泡效率最大的條件，并要考慮成本及對終產(chǎn)物的影響。物理消泡法方 法罐內(nèi)消泡法： 可在攪拌軸上安裝消泡漿（最簡單的方法）。 罐外消泡法： 將泡沫引出罐外，泡沫消除后再回罐內(nèi)。 原 理靠機(jī)械力引起強(qiáng)烈振動(dòng)或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機(jī)械力將排出氣體中的液體加以分離回收。優(yōu) 點(diǎn)不需要引進(jìn)外界物質(zhì)、節(jié)省原材料、減少污染機(jī)會(huì)。缺 點(diǎn)不能從根本眾消除引起穩(wěn)定泡沫的因素。化學(xué)消泡法機(jī) 理n 消泡劑消泡的原理：降低泡沫液膜表面的機(jī)械強(qiáng)度；降低泡沫液膜表面的黏度。n 當(dāng)泡沫的 表層 存在著由 極性的表面活性物質(zhì)形成雙電層 時(shí)，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度或加入某些具有強(qiáng)極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭奪液 膜上的空間，降低液膜強(qiáng)度，使泡沫破裂。n 當(dāng)泡沫的液膜具有較大的 表面粘度 時(shí)，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。選擇消泡劑的依據(jù)? 對發(fā)酵過程無毒，對人、畜無害和不影響酶的生物合成。? 消泡作用迅速，效果高和持久性能好? 能耐高壓蒸氣滅菌而不變性，在滅菌溫度下對設(shè)備無腐蝕性或不形成腐蝕性產(chǎn)物。? 不影響以后的提取過程。? 消沫劑的來源多，價(jià)格低，添加裝置簡單。? 不干擾分析系統(tǒng)，如溶解氧、 pH測定儀的探頭。? 最好還能做到不影響氧的傳遞。消泡劑的種類和性能? 天然油脂：? 常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油及豬油等。? 化學(xué)合成物質(zhì)：? 聚醚類：在生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油 (又稱泡敵 )。? 高級(jí)醇類：十八醇是較常用的一種，可以單獨(dú)或與載體一起使用。據(jù)報(bào)導(dǎo)，它與冷榨豬油一起控制青男素發(fā)酵的泡沫，效果較好。聚二酵具有消沫效果持久的特點(diǎn)，尤其適用于霉菌發(fā)酵。? 硅酮類：硅酮類消沫劑主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。六、 CO2對發(fā)酵的影響及控制（ p172174）CO2是微生物的代謝產(chǎn)物，它是細(xì)胞代謝的重要指標(biāo)。同時(shí)也是某些合成代謝的基質(zhì)。在發(fā)酵過程中， CO2有可能對發(fā)酵有 促進(jìn) 作用，也有可能有 抑制 作用。（一） CO2對發(fā)酵的影響216。一般適宜的 CO2濃度為 %～ %。216。CO2濃度過高對菌體具有抑制作用：當(dāng)排氣中 CO2的濃度高于 4%時(shí)，微生物的糖代謝和呼吸速率下降。216。例如，發(fā)酵液中 CO2的濃度達(dá)到 10 1mol， 就會(huì)嚴(yán)重抑制酵母的生長；當(dāng)進(jìn)氣口 CO2的含量占混合氣體的 80%時(shí)，酵母活力與對照相比降低 20%。216。CO2對發(fā)酵也有影響216。對發(fā)酵促進(jìn)：216。如牛鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)多糖，最重要的發(fā)酵條件是提供的空氣中要含 5%的 CO2 。216。對發(fā)酵抑制：216。如對肌苷、異亮氨酸、組氨酸、抗生素等發(fā)酵的抑制。216。影響發(fā)酵液的酸堿平衡● CO2溶于水后形成 HCO3主要是影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜的流動(dòng)性及表面電荷密度發(fā)生改變，影響到細(xì)胞膜的輸送效率，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制、形態(tài)發(fā)生改變?！?培養(yǎng)液中的 CO2主要作用于細(xì)胞膜的脂質(zhì)核心部位?！?HCO3影響細(xì)胞膜的膜蛋白。（二） CO2對發(fā)酵影響的機(jī)理（三） CO2的控制? CO2在發(fā)酵液中的濃度變化不像溶解氧那樣有一定的規(guī)律。它的大小受到許多因素的影響，如細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液的流變學(xué)特性、通氣、攪拌程度、罐壓大小、設(shè)備規(guī)模等。? 在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)通風(fēng)和攪拌來控制。? 如果對產(chǎn)物形成有抑制作用，要降低其濃度；如果有促進(jìn)作用，則提高其濃度。七、高濃度微生物的培養(yǎng)（補(bǔ)充）? （一）為什么要采用高濃度微生物的培養(yǎng)？? 微生物利用分批培養(yǎng)技術(shù)，但發(fā)酵液中最終細(xì)胞濃度不高。如果通過改進(jìn)工藝技術(shù)，使發(fā)酵液中微生物細(xì)胞增殖到很高的濃度，那么， 高濃度的細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生高濃度的發(fā)酵產(chǎn)物， 這樣就可以大大提高發(fā)酵設(shè)備的利用率，降低生產(chǎn)成本?；谶@種目的，人們開始研究微生物高細(xì)胞濃度的培養(yǎng)技術(shù)。? 采用高細(xì)胞濃度培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)酵液中菌體濃度比分批式培養(yǎng)可 高 10倍以上 。– 例如用高細(xì)胞濃度連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)大腸桿菌 HBl01 (pPAKS2)，可得到95g／ L的菌體。用同樣的方法培養(yǎng)酒精酵母可得到 219g／ L的菌體。– 而一般用分批法培養(yǎng)酵母和細(xì)菌，得到的菌體濃度僅為 10g／ L左右。 高密度培養(yǎng)技術(shù)（ High Celldensity Culture）? 是指利用一定的培養(yǎng)技術(shù)或裝置提高菌體的密度，使菌體密度較分批培養(yǎng)技術(shù)有顯著的提高，最終提高特定產(chǎn)物的比生產(chǎn)率的技術(shù)。（二）高細(xì)胞濃度培養(yǎng)技術(shù)的原理 采用一定的工藝技術(shù)，保證微生物生長的適宜條件， 延長微生物的指數(shù)增殖過程， 從而得到高濃度的細(xì)胞 。（三）高細(xì)胞濃度培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)v可大大提高發(fā)