基因結(jié)構(gòu)與表達分析的基本策略(編輯修改稿)
2025-01-25 18:05 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 Mullis K. 1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復制過程的核酸體外擴增技術。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 53 The replication of DNA 54 原理： PCR是模擬天然 DNA復制過程 ， 利用 DNA 聚合酶催化一對引物間特異 DNA片段合成的體外擴增技術 。 其主要熱循環(huán)過程為：變性 、退火 、 延伸三個步驟 。 55 1. PCR循環(huán)由三步組成： ①變性 （ denaturation） ②退火 （ annealing） ③延伸 （ extension） 高溫 合適溫度 合適溫度 56 57 58 2. PCR擴增終產(chǎn)物大小 : 介于兩條退火引物 5′ 末端之間的 雙鏈 DNA片段 。 循環(huán)一 59 循環(huán)二 60 循環(huán)三 61 一對引物：正向和反向 限制了 PCR擴增的片段的范圍 5/— — 5/ — 3/ 3/— 5/— — 5/ — 3/ 3/— 62 5′ CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG 3′ GGTCCAGTACTACTACCCGT AGAACATGGTGCGCAGGTT 3. 引物設計實例 63 Y=A（ 1+E） n Y: 擴增產(chǎn)物的量 A: 最初靶 DNA分子數(shù) E: PCR擴增效率 n: 循環(huán)次數(shù) 3. PCR產(chǎn)量 當 E＝ 100％ , A=1時 Y=2n 2n(引物延伸產(chǎn)物的量） 64 （二）平臺期與平臺效應 1. 平臺效應 （ plateau effect）： PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后， DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進入線性增長期或靜止期， 即平臺效應 。 影響因素： ① 引物及 dNTP底物濃度降低。 ② 酶與模板比例下降。 65 PCR平臺效應 66 （二）耐熱 DNA聚合酶 1. Taq DNA聚合酶（ 實現(xiàn)了 PCR自動化） 從嗜熱水生菌 thermus aquatics YT1株中直接分離出來。 ● 95℃ 的半衰期 : 40 min ● 最適溫度 : 72 ℃ ～ 80 ℃ ● 催化反應速率 : 150～ 300核苷酸 / 秒 / 酶分子 67 68 Taq DNA聚合酶特性： ● 5′→3′ 聚合酶活性； ● 5′→3′ 外切酶活性； ● 較弱的非模板依賴性； ● 缺乏 3′→5′ 外切酶活性。 69 PCR thermal cycler 70 PCR產(chǎn)物的 瓊 脂糖凝膠電泳分析 500bp 400bp 200bp 300bp 1000bp 600bp 700bp 800bp 900bp Marker PCR產(chǎn)物 71 無機離子及抑制劑的影響 Taq DNA聚合酶的活性 對 Mg 2+ 濃度和單價離子（ K+或 NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。 最適 Mg 2+濃度 ： 2 mmol/L K+濃度 ： 50 mmol/L 72 ? 幾種高保真的耐熱 DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶 73 （三） PCR引物設計原則 引物的化學本質(zhì)是什么？ 單鏈寡核苷酸 DNA或 RNA片段。 DNA復制引物：單鏈 RNA片段 PCR引物： 單鏈 DNA片段 74 PCR引物設計原則 ： 或發(fā)夾結(jié)構(gòu) DNA聚合反應 (錯配 ) 75 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′ 特異擴增 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′ 錯誤引發(fā) 1. 引物與模板的序列要緊密互補 2. 引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA聚合反應 (錯配 ) 76 引物之間應避免 3′ 端互補 或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 77 引物自身不應形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 78 : ① 引物長度 : 10～ 30 nt ② 堿基分布 : A、 T、 G、 C 隨機分布 ③ G+C含量 ： 40 ～ 60% Tm=4(G+C)+2(A+T)
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