【文章內容簡介】 60。1948年 Wieland 發(fā)明紙電泳，使電泳技術大為簡化。此后，電泳技術發(fā)展迅速，特別是電泳技術與層析法，免疫學方法的結合，使其分辨率達到 mg/ml水平，成為醫(yī)學檢驗的一種重要分析技術。（二） 溶液中粒子的帶電狀態(tài)蛋白質分子電離時 有帶正電荷的氨基 ，也有電離 帶負電荷的羧基 ，故蛋白質是一種兩性電解質。在酸性條件下，羧基電離受抑制，－ NH2→NH 3+帶 正電在堿性條件下，羧基電離增強，－ COOH→ － COO－ 帶 負電 。（三） 電泳遷移率指帶電粒子在單位電場強度作用下的電泳速度 ，通常用 μ表示μ=V/EV為粒子移動速度（ cm/s） E為電場強度（ V/cm）遷移率取決于帶電粒子的性質（粒子所帶電量 Q，粒子大小 r形狀）介質粘度 η，對于球狀分子，根據(jù) Stoke定律V=QE/6πrηU=Q/6πrη在實際測定中，電泳速度 V以單位時間 t（秒）內移動的距離 d（厘米）表示 V=d/t（ cm/s）電場強度 E以單位長度 I（厘米）上所施加的電勢差 V（伏特）表示E=V/I（ V/cm）故 u=V/E=（ d/t） /（ V/I）=dI/Vt（ cm2/） 通過測量 d,l,v,t便可計算出顆粒的遷移率。由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因此在同一電場中的移動距離不同，故能將其分離，根據(jù)公式dA=μAdB=μBA、 B移動距離差為Δd=(dA—dB)= （ dA—dB ） 分離距離與電壓和電泳時間成正比，與支持物長度成正比。二、 電泳的分類和電泳儀（一） 電泳的分類1.根據(jù)被分離樣品的多少 分析電泳，制備電泳。2.根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳，高壓電泳。3.根據(jù)是否使用支持介質 自由電泳，區(qū)帶電泳。4.根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一 連續(xù)電泳，不連續(xù)電泳。 （二）電泳儀由直流電源和電泳槽兩部分組成。直流電源 將交流電源經(jīng)整流，濾波后獲得。分為（ 1）恒壓電源 電泳過程中的電壓恒定不變。但電泳過程中的熱效應，降低外周電路的電阻，使電流慢慢增大。（ 2）恒流電泳 電泳過程中的電流恒定不變。用這種電流的輸出電壓可隨外周阻力減少而減少，從而保持電流恒定。（ 3）恒功率電源 電泳中輸出功率恒定不變。主要用于等電聚焦電泳。 盛裝緩沖液和進行電泳分析的場所，一般用塑料和有機玻璃制成，它包括電極，緩沖液槽，電泳支架，透明蓋組成。電泳槽的外形有水平式，垂直式，圓盤式等多種。電極應具有良好的導電性，抗腐蝕性和抗電解作用。以鉑金材料最為理想，最好貫穿整個緩沖液槽。三、影響電泳的因素（一）緩沖液 維持電泳介質 pH恒定，并起導電作用。 由弱酸和弱酸鹽組成，常用的有磷酸鹽，硼酸鹽，巴比妥鹽和三羥甲基氨基甲烷（ Tris）等，其中巴比妥緩沖液用的最多，由巴比妥鈉和巴比妥組成。選擇緩沖液時應考慮的因素：（ 1）化學性能穩(wěn)定，不易水解。（ 2）緩沖液的 pH應與弱酸的 pK值接近，有較強緩沖能力。（ 3）緩沖液中正負離子應有相近的遷移率，避免電暈出現(xiàn)正負離子分布不均。（ 4）緩沖液的離子應該是一價的，多價離子有較厚的雙電層，移動性差。（ 5）緩沖液的電導率要低， 避免通電時產(chǎn)生較多的熱。緩沖液 pH決定了蛋白質的帶電狀態(tài)，電泳時應選擇一個合適 pH，使各種蛋白質在這一pH時凈電荷差別最大以利于分離。血清蛋白醋酸纖維薄膜電暈常用 。各種蛋白質均帶負電荷，電泳時向正極移動。 緩沖液 pH的計算pH=pKa+lg([鹽 ]/[酸 ])電泳過程水會發(fā)生電離。正極： 2OH－ →H2O ＋ 1/2O2↑＋ 2epH↓負極： 2H＋ ＋ 2e→H2↑ pH↑故電泳 2～ 4次后應將緩沖液正極交換，減少這種影響。 是指溶液中各種離子的摩爾濃度（ Ci）與其電荷數(shù)平方（ Zi2）乘積總和的 1/2。即　 I=1/2∑CiZi2I的單位是 mol/L。如 NaCLI=I=對于緩沖液 I計算，由于弱酸的電離度很低，一般只計算鹽的。I愈大，緩沖能力越大， pH越穩(wěn)定 ，但緩沖液所載分電流增加，樣品所栽的電流減少，電泳速度減慢，導電能力增加，產(chǎn)熱增加。I過小，緩沖能力小， pH不穩(wěn)定 ，緩沖液所載分電流減少，樣品所載分電流增加，緩沖液粘度系數(shù)降低，電泳速度加快。但樣品在支持物上擴散嚴重，分辨率降低。 兼顧兩方面的影響， 一般在 ~mol/L。（二）支持介質 對支持介質的基本要求是具有化學惰性，不與被分離的樣品或緩沖液起化學反應，并具有一定的堅韌度。 使被分離樣品滯留，而降低電泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。 電泳過程中液體對固體支持物的相對移動稱為電滲。 實際上是電泳材料表面的電荷引起水的定向移動。當電滲作用方向與電泳方向一致，電泳速度加快，順水行舟。當電滲作用方向與電泳方向相反，電泳速度減慢，逆水行舟。 四、常用電泳技術區(qū)帶電泳是目前應用最廣泛的一種電泳技術，區(qū)帶電泳的支持介質常用的有濾紙，醋酸纖維薄膜，凝膠等。（一） 濾紙電泳（ PE）是應用最早的支持介質。 優(yōu)點： 材料價廉易得，有一定機械強度。 缺點： 電泳時間長， 8～ 10h，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。 （二） 醋酸纖維薄膜電泳（ CAE）1957年 Kohn首先采用，醋酸纖維素是將纖維素分子中葡萄糖單體上的羥基乙?；纬衫w維素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶劑溶解，涂成均勻薄膜。優(yōu)點： 對蛋白質吸附作用很小，分辨率高，區(qū)帶清晰，不吸附燃料，區(qū)帶周圍燃料可完全清掉，檢測靈敏度較高，樣品用量少 ~2μl，電泳時間短 20min~1小時，可透明，便于用光密度掃描儀定量。缺點： 有輕度電滲作用，吸水性較差，較脆。（三）瓊脂糖凝膠電泳（ AGE）瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖。主要由半乳糖和 L3， 6脫水半乳糖構成。常用濃度 ~% 。優(yōu)點： 吸附作用，電滲作用很小，故分辨率重現(xiàn)性好，應用廣，同工酶，脂蛋白，免疫電泳，樣品用量少 ~，電泳時間短30min~1h。透明度好，電泳后可直接掃描定量，也可烘干制成薄膜。缺點： 電泳完畢后區(qū)帶易擴散，可及時固定。點樣方法，挖孔法，濾紙插入法。（四） 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是一種人工合成的高分子材料， 60年代新用于電泳分析，能將血清蛋白分為 20多種組成。優(yōu)點：，分離效果好。，是一種穩(wěn)定的親水膠體。，無色透明，可直接光密度掃描。離。 1.聚合丙烯酰胺＋甲叉丙烯酰胺 聚丙烯酰胺（ Acr）單體 （ Bis）交聯(lián)劑化學摧化 過硫酸銨 TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)加速劑 TEMED促使引發(fā)劑過硫酸銨形成自由基，自由基與 Acr接能，使 Acr單體形成自由基而活化，從而引發(fā)聚合，聚合速度與 pH，單體濃度，溫度有關。催化系統(tǒng)引發(fā)劑 加速劑光催化 核黃素 TEMED系統(tǒng)，核黃素經(jīng)光照被還原成無色核黃素，在和痕量氧的條件下，無色核黃素又被氧化成核黃素自由基，使 Acr活化，從而引發(fā)聚合。優(yōu)點： 核黃素用量少（ 10mg/L），對樣品分析無影響，聚合時間可通過調節(jié)光照時間，強度來控制。 凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定。凝膠總濃度 T（ g/dl）表示 100ml凝膠中Acr和 Bis的總克數(shù)， T值越大，孔徑越小。交聯(lián)度 C（ % ）表示交聯(lián)劑 Bis占凝膠總濃度 T的百分比 ， C值越大，孔徑越小。T值固定不變時， C值在 5% 時，凝膠孔徑最小，大于或小于 5% ，孔徑都會增大 。常用標準膠 T=，孔徑約 5nm。160