【正文】 第五章 常用生物化學(xué)檢驗技術(shù)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)第二節(jié) 電化學(xué)分析第三節(jié) 電泳技術(shù)第四節(jié) 層析技術(shù)第五節(jié) 自動生化分析技術(shù) 光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能而建立起來的一類分析方法，因不同分子的原子和原子團(tuán)，其發(fā)射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質(zhì)在一定條件下，其發(fā)射光譜和吸收光譜的強(qiáng)度與該物質(zhì)的含量成正比關(guān)系。因此可對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，此類技術(shù)稱為光譜分析技術(shù)。光譜分析技術(shù)是一種最常用的生化檢驗技術(shù)，它主要包括：吸收光譜分析： 可見、紫外、紅外分光光度法和原子吸收分光光度法散射光譜分析： 散射比濁法和透射比濁法發(fā)射光譜分析： 火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法 光是一種高速傳播的電磁波，光的波長（λ）的常用單位是納米（ nm），可見光波長400～ 760nm，＜ 400nm稱為紫外光，＞760nm稱為紅外光，波長愈短，能量愈大。可見、紫外吸收光譜是由于多原子分子的價電子在電磁輻射的作用下，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，這種因物質(zhì)分子對輻射能的選擇性吸收而得到的光譜稱為 吸收光譜 。第一節(jié) 吸收光譜分析吸收光譜分析法包括 可見、紫外、紅外和原子吸收分析法。其中最常用的是可見光分析法，也被不嚴(yán)格地稱為比色分析法，準(zhǔn)確的名稱應(yīng)是可見光分光光度法。用于比色分析的光源與被測溶液的顏色應(yīng)為互補(bǔ)色?？梢姟⒆贤馕展庾V用于定量分析的依據(jù)是 光吸收定律 ，即 LambertBeer定律 ，它是吸收光譜法的基本定律。一、 LambertBeer定律1.Lambert定律 當(dāng)一束強(qiáng)度為 Io的單色光透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，則透過的光線為 It。當(dāng) 溶液濃度不變 時，透過的液層愈厚，則光線強(qiáng)度的減弱愈顯著。ItI0 用數(shù)學(xué)式表示為： 透光度隨溶液厚度增加而減少，其關(guān)系是 透光度的負(fù)對數(shù)（ － lgT，吸光度 A）與溶液厚度成正比 ，即2.Beer定律 當(dāng)一束強(qiáng)度為 Io的單色光透過某種吸光溶液后，若 液層厚度不變，而濃度不同時，溶液的濃度愈大，則透過光的強(qiáng)度愈弱，其定量關(guān)系 A=K C。當(dāng)液層厚度不變時，吸光度與溶液濃度成正比，這就是 Beer定律。3.LambertBeer定律合并 Lambert定律與 Beer定律可得A=K L C說明吸光物質(zhì)對單色光吸收的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。吸光系數(shù) K的物理意義是 吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時的吸光度 ，在給定條件下（波長、溶液性質(zhì)、濃度）吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)， K值愈大，能測定的濃度 C愈小，則靈敏度愈高。二、比色分析儀器 即可見光分光光度計，各類分光光度計的結(jié)構(gòu)和原理基本相同，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測器和顯色器五大部分。1.光源 可見光常用鎢燈，現(xiàn)用鹵鎢燈；紫外光常用氫燈。2.單色器 可用濾光片、棱鏡、光柵。3.吸收池 (比色杯 )4.檢測器 光電管或光電倍增管5.顯示器 指針式或數(shù)字式三、比色分析的特點1.靈敏度高 被測定物質(zhì)的最低濃度一般為 10－ 5～ 10－ 6mol/L。2.測定快速、簡便。3.應(yīng)用范圍廣 一些無色物質(zhì)在一定條件下與顯色劑反應(yīng)，可生成有色物質(zhì)。四、比色分析的定量方法（一）對比法 又稱標(biāo)準(zhǔn)對比法，通常在測定未知濃度樣品的同時，測定一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液作比較，然后分別測定兩者的吸光度。 AS=KLSCSAR=KLRCR因測定成分相同，故 K值相同，比色時用同樣規(guī)格的比色皿故 LS=LR，所以比色分析中測定標(biāo)準(zhǔn)液與未知液吸光度的比值也就等于其濃度的比值，即若標(biāo)準(zhǔn)液與樣品用量不等時，則再乘 用對比法進(jìn)行定量時，為了減少誤差，選用標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)盡可能接近待測樣品濃度。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)液，按一定操作方法顯色后，用選定的波長分別測定它們的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上標(biāo)出各坐標(biāo)點，通過連接各點，使其成一直線，即 AC曲線。A24681012C注意事項1.測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。2.標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。3.當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。4.標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致。用波長 200～ 400nm的紫外光譜測定無色物質(zhì)的方法稱為紫外分光光度法 。芳香族類及含有共軛雙鍵的烯烴、炔烴等不飽和烴類，在 200～ 400nm波長范圍具備光吸收特性，故不需經(jīng)顯色反應(yīng)就能直接利用紫外分光光度法測定，其選擇性和靈敏度均高于比色分析法。五、紫外分光光度法五、紫外分光光度法（一）單組分測定原理其基本原理與可見分光光度法相同，除可采用前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和對比法外，還可采用：1.吸光系數(shù)法 對于 單一組分的純物質(zhì) ，只要已知其摩爾吸光系數(shù)，測得吸光度（ A）后，可直接按下列公式計算物質(zhì)的濃度。例： 已知維生素 B12的水溶液在 361nm波長處的 ε為 28056， 2ml維生素 B12的水溶液用蒸餾水稀釋到 4ml，用 1cm比色杯測得溶液的吸光度為 ，求該維生素 B12水溶液的濃度。（二）多組分混合物的測定原理多組分指同一試樣中含兩種或兩種以上待測組分，測定時可根據(jù)各組分吸收光譜的重疊程度來確定定量方法。1.各組分吸收峰不相互重疊按單組分測定方法2.各組分吸收峰相互重疊可采用解聯(lián)立方程法，等收吸雙波長法、系數(shù)光譜法。（一）火焰光度法是利用火焰使金屬元素激發(fā)，能發(fā)射出特征譜線的特點進(jìn)行測定的一種方法。 某些金屬元素的基態(tài)原子受到火焰激發(fā)后，其外層電子獲得能量而從基點躍遷到激發(fā)態(tài)，接著它們又以發(fā)射光譜的形式釋放出所獲得的能量，而返回基態(tài)，在相同條件下，同一元素所釋放的單位能量相同，故能形成固定光譜。六、其它光譜分析技術(shù)六、其它光譜分析技術(shù)如 鈉 發(fā)射光譜波長 589nm， 鉀 發(fā)射光譜波長 767nm。由于火焰供給的能量不強(qiáng)， 只能激發(fā) 堿金屬 和 堿土金屬 元素 ，生化檢驗中常用于鉀、鈉的測定。元素的發(fā)射譜線強(qiáng)度與該元素濃度的關(guān)系可表示為 I=acba是與試樣組成，激發(fā)溫度，激發(fā)電位有關(guān)的 常數(shù) ， b為 自吸收系數(shù) ，當(dāng)濃度很低時，b≈1，所以上式可寫成 I=ac，即發(fā)射譜線強(qiáng)度與測定元素濃度成正比。（ 1）共存元素的干擾① 共存元素產(chǎn)生的輻射干擾 由于火焰使標(biāo)本中其他元素激發(fā)，當(dāng)發(fā)射時光譜接近，甚至重疊時，可產(chǎn)生干擾，引起誤差，如鈣對鋰、鈉的測定干擾明顯。② 陽離子的干擾 主要是通過對待測陽離子的電離度產(chǎn)生影響，造成發(fā)射時強(qiáng)度的改變。③ 陰離子的干擾 因陰離子可與某些被測陽離子在火焰溫度下形成僅能緩慢蒸發(fā)的化合物而抑制了原子激發(fā)，一般用釋放劑來消除干擾，與干擾陰離子牢固結(jié)合。（ 2）火焰對測定的影響火焰是激發(fā)光源，火焰的純度和燃燒狀態(tài)，穩(wěn)定性，可直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此，要求所用燃料燃燒時火焰背景色淺，溫度高，無雜色。 （ 3） 標(biāo)準(zhǔn)品的影響由于生物樣品中成分復(fù)雜，定量測定中會互相干擾影響測定的準(zhǔn)確性，所以，如果以單純的被測物質(zhì)預(yù)制標(biāo)準(zhǔn)液則與血清樣品的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，故應(yīng)使用血清作為標(biāo)準(zhǔn)以消除影響。（二）原子吸收分光光度法 1.基本原理 待測元素經(jīng)原子蒸氣發(fā)生器轉(zhuǎn)化成氣態(tài)原子（處于基態(tài)），由空心陰極燈提供的待測元素的共振線經(jīng)過待測元素的蒸氣，共振輻射強(qiáng)度被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子吸收而減弱，其吸收規(guī)律遵循 Beer定律。共振線： 電子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級所吸收的譜線為共振吸收線 。簡稱為共振線。2.應(yīng)用 在醫(yī)學(xué)檢驗中主要用于體液、毛發(fā)、指甲等組織鈣、鎂、鐵、鈉、鋅、鋁、汞、鉛、砷等多種元素的測定。優(yōu)點：① 選擇性好 受干擾少，原子吸收是光的窄帶吸收，僅 ～ ，而分子對光的吸收是寬帶吸收，達(dá)幾個 nm。② 靈敏度高 能測定 10－ 9～ 10－ 6g的元素。③ 測定快速、簡便④ 應(yīng)用范圍廣 只需更換不同空心陰極燈，儀器昂貴。（三）熒光分析法利用某些物質(zhì)光致發(fā)光的特性，籍此對物質(zhì)進(jìn)行定性，定量分析的方法。 某些物質(zhì)的分子吸收了光能，從基態(tài)躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中的某一振動能級，處于激發(fā)態(tài)的振動能級中的分子通過運動或與其他分子的碰撞而將吸收過多的能量輸給其他分子，并返回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，同時發(fā)射熒光，躍遷到基態(tài)發(fā)射熒光，在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與溶液濃度呈線性關(guān)系。（ 1）溶劑 增大溶劑的極性，可時電子躍遷的能量降低，熒光增強(qiáng)。（ 2）溫度、 pHT↑分子碰撞頻率 ↑，因此熒光強(qiáng)度隨溫度升高而減弱。 pH可影響化合物電離或使熒光物質(zhì)水解，如苯胺在 pH7～ 12溶液中主要以分子形式存在，產(chǎn)生藍(lán)