【正文】 新 張秀明 5.4.3.何謂光吸收定律（ LambertBeer定律）？ 1.復(fù)習(xí)思考題火焰光度法（基本原理、影響火焰光度法測定的因素）；熒光光度法（基本原理、影響熒光強度的因素、 3.可見分光光度法（光吸收定律、比色分析儀器、比色分析的特點及比色分析的定量方法）；原子吸收分光光度法。2. 1.本章小結(jié)各種有關(guān)試劑分層鋪在一薄膜內(nèi)，膜分 4層，涂布層、去蛋白。（四）干片式分析儀離心轉(zhuǎn)頭是這類分析的特殊結(jié)構(gòu)。（三）離心式自動生化分析儀透析器，去蛋白、比色計、分光光度計、熒光光度計吸取、分配、輸送試劑 放置待測樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品各種類型的自動生分析儀一般由以下幾個部分組成。二、自動生分分析的結(jié)構(gòu)特點可往意編程的可根據(jù)使用者的需要進行程序的更改、變換、增減。分為固定程度序和可往意編程的兩類。（四）測定按測定程序可否改變分類中型的有單通道也有多通道，單通道的可用更換程序而更換測定項目，可選幾十次，多通道的則可用時測定 2～ 10個項目，但一般只能測定臨床常規(guī)生化項目，而大型的則往往可同時測定 10個以上項目，且分析項目可自由選擇、組合。分為小型、中型、大型三類。（三）按儀器的復(fù)雜程度和分析功能分類（二）按同時可測項目分類前兩者屬于回順序分析，因化離心力的作用下，各樣品與試劑幾乎是同時被混合，反應(yīng)并被測定。第三代是每個待測樣品與試劑混合的化學(xué)反應(yīng)都是分別在各自的反應(yīng)杯中完成的。 （一）按機械設(shè)計原理分類一、自動分析儀的種類在臨床生化檢驗中 HPLC已用于類同醇激素、兒茶酚胺的測定，同工酶的分離，治療藥物的監(jiān)測和篩選。 HPLC） 又稱為高效液相色譜法，始于 60年代末，是在經(jīng)典液相層折法基礎(chǔ)上引進氣相層折理論發(fā)展起來的，它具有氣相層折的全部優(yōu)點，同時克服了氣相層折的缺點，具有分離能力強，測定靈敏度高（ ng水平）應(yīng)用范圍廣（極性到非極性、小分子到大分子、熱穩(wěn)定與不穩(wěn)定化合物），在室溫下進行等優(yōu)點。liguid用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入同一凝膠柱，在同一條件下層折，測定每種組分的保留體積，并以保留體積對分子量的對數(shù)作用，得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。廣泛用于酶蛋白質(zhì)、 AA、核苷酸多糖、激至少、抗生素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。（ 3）用于分離提純 如蛋白質(zhì)的稀溶液需要濃縮時，可加入葡聚糖 G25或 G50的干膠，蛋白質(zhì)稀溶液中的水份及小分子物質(zhì)進入凝膠顆粒內(nèi)部孔隙中，蛋白質(zhì)則在顆粒外，將溶脹后的凝膠分離除去，得到濃縮的蛋白質(zhì)濃液。（ 2）高分子溶液的濃縮 大分子物質(zhì)溶液粘度隨濃度增大而增大，而影響分離效果，一般將粘度控制在 5cp（厘泊）以下，樣品體積小于凝膠總體積的 5％～ 10％。稱為內(nèi)水， Vo指凝膠顆粒之間水的體積，稱為外水，裝柱良好的凝膠柱，其 Vo/Vi的比值應(yīng)為 40％～ 60％。Vo和 Vi的比值，分離時需維持一定的靜水壓，孔徑愈大，最高靜水壓愈低，如 G10，最高靜水壓 100cm，而 G100、35cm。（ 3）靜水壓 （ 1）柱直徑與長度 0～ 40℃ 、 pH機械強度大，分子量使用范圍寬（達 108），吸附生物高，分子勇最低常用生物高分子物質(zhì)的分離，但穩(wěn)定性很差，使用條件限制很嚴(yán)格 2B、 4B、 6B，數(shù)字表示瓊脂糖含量（ W/W ）。（ 3）瓊脂糖凝膠 層析用的聚丙烯酰胺凝膠商品名為生物凝膠 P（ BiogelP），是由丙烯酰胺（ Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（ Bis），經(jīng)自由基引發(fā)聚合而成，型號有 P2， P4，P6， P10， P30， P60， P100， P150， P200， P300，可分離子肽及蛋白質(zhì)量， 100～ 40萬。穩(wěn)定性好，不溶于水，但在酸性條件下糖易水解，由于分子中會有大量羥基，因此有很大的吸水性，吸水后溶脹成透明，而且有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的彈性顆粒，孔徑的大小與交聯(lián)度有關(guān)，交聯(lián)度大，孔徑小、吸水量小，商品膠型號多以吸水量 10倍表示，如每克干膠吸水量為 ，即為 G25型，最常用的交聯(lián)葡聚糖商品名為 Sephadex。（ 1）葡聚糖凝膠 常用的凝膠有葡聚糖、凝膠、聚丙烯酰凝膠和瓊脂糖凝膠。固定相是多孔凝膠，商品凝膠是干燥顆粒，當(dāng)吸收一定量液體后溶脹成一種柔軟而富有彈性、不帶電荷、不與溶質(zhì)互作用的惰性物質(zhì)，由于凝膠有一定孔徑，對分子大小不同的組分的阻滯作用不同。（二）凝膠層折在生化檢驗中的應(yīng)用 等溶劑揮發(fā)后，用相應(yīng)顯色劑顯色。（ 2）點樣 制成的板要求涂布均勻，晾干、活化。 干法、濕法和燒結(jié)法。即展開劑，展開劑的選擇是薄層層折中又一關(guān)鍵，一般極性大的化合物需用極性大的展開劑。（ 2）流動相 為了使每次測定的 Rf值恒定，吸附劑要求顆粒大小均勻、適當(dāng)，顆粒細(xì)、吸附能力強，展開慢、顆粒粗、吸附能力弱，展開快、分離放開差，一般顆粒直徑為無機類 ～ （ 70～ 140目）。③ 顆粒狀大小 常稱為活度，主要受吸附劑含水量的影響，含水量高活度低，從強到弱分為 I、 Ⅱ 、 Ⅲ 、 Ⅳ 、 Ⅴ 5級，活度強吸附作用強，一般分離水溶性物質(zhì)活度弱些，而分離脂溶性物質(zhì)活度要強些。② 吸附能力 如硅膠是弱酸性吸附劑，適合于酸性和中性物質(zhì)的分離，氫化鋁是微堿性吸附劑，適合于堿性和中性物質(zhì)分離，硅薄土、纖維素、屬性吸附劑。為吸附劑，常用的有硅膠、氯化鋁、硅薄土纖維素等，固定相選擇時應(yīng)考慮的因素。（一）薄層層析在生化檢驗中的應(yīng)用（ 4）薄膜層析法（ TFC） 用高分子有機吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進行物質(zhì)的分離。將顆粒狀的固定均勻地鋪在薄板上，點樣后用流動相展開。（ 1）柱層析法（ CC） 固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動向到分離。利用各組分生物學(xué)特殊性不同而建立的一種層析方法，固定相工能和一種待分離成分類一結(jié)合，使其與其他物質(zhì)分離，如利用抗原、抗體的結(jié)合來分離相應(yīng)的抗原或抗體。固定相為多孔性凝膠，利用各組分分子大、形狀不同在凝膠中受阻滯的程度不同而分離。（ 3）離子交換層析法（ IEC） 固定相是液體利用各組分化流動相和預(yù)止液相同（固定相）中的分配系數(shù)不同的分離。固定相是固體吸附劑，利用各組化吸附劑表面吸附能力的差別而分離。（分離原理）分類氣相層析液相層析氣固層析氣液層析液固層析液液層析層析法（二）層析法分類如紙層析、薄層層析、薄膜層析、層析移動的速度用比移值或阻滯因子（ Rf）來表示。如水、某些溶劑和氣體。層析法是利用待分離物質(zhì)中不同組分的某些理化性質(zhì)（在兩相中溶解、吸附、紊和作用等）的差異而建立起來的一種分離技術(shù)。第四節(jié) 層析技術(shù) 層析法又稱色譜法、色層分離法， 1906年由俄國植物學(xué) Jauett首先用于植物色素的分離提取而得名。轉(zhuǎn)移電泳的優(yōu)點 :方法有，放射自顯影，酶標(biāo)免疫化學(xué)等。轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)包括三個步驟EasternWestern1979年 Towbinblot。將此法應(yīng)用于 RNA研究，取名 bolt此項技術(shù)是 1975年由Southern在進行 DNA片段的研究中首先使用。（三） 通常將等電聚焦電泳為第一相電泳，以 SDS聚丙烯酰胺凝膠為第二相電泳。方向上進行第二次電泳分離。雙向電泳 是先把樣品從一個方向進行電泳分離，然后在與其成 90。 （ 4） 對 280（ 2） 各成分的 pI彼此接近，并在 pI附近有良好的緩沖能力。如瑞典 LKB公司生產(chǎn)的商品名為“Ampholine”的，它由丙烯酸和多乙烯多胺合成。 ② 有一個抗對流的材料，防止已分離樣品重新混合。 在電泳系統(tǒng)中建立一個從正極到負(fù)極， pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定的 pH梯度。 pH單位，特別適用于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)分子。是利用具有線性 pH梯度的兩性電解質(zhì)為載體，分離等電點不同的蛋白質(zhì)等兩性分子的一種電泳新技術(shù)。操作繁瑣，費時，準(zhǔn)確度不如光密度儀直接掃描法。透明的電泳圖譜可用光密度儀直接掃描得出各組分的百分率。 γ:15%:7%總蛋白 75如同時測定了蛋白質(zhì)總量，也可換算成各組分的絕對量（ g/L蛋白質(zhì)電泳的定量分析通常以各區(qū)帶占總量的百分率表示 （三）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定量分析 經(jīng)染色后，首先應(yīng)仔細(xì)觀察有無異常區(qū)帶。（二）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性分析 常用的染色劑有氨基黑 10B，溴酚藍(lán)，麗春