【文章內容簡介】 為防止在標準溶液加入及渦旋混合時造成的損失 —— ① 先加入標準溶液 ③ ② 再加入空白生物基質 ③ 渦旋混勻 ① ② 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 36 體內藥物分析 4. 標準曲線的繪制 以待測藥物的檢測響應 (如色譜峰面積或峰高 ) 或與內標物質的檢測響應的比值 (內標法 )(因變量 , y )對模擬血藥濃度 (自變量 ,x) —— 求得回歸方程 ( y＝ a＋ bx )及其相關系數 ( ? ) 在一組由至少 7個濃度 (不包括零點 )構成的標準曲線中 ， 至多可有 2個濃度點數據 ， 可予剔除 。 但應有確切原因 ， 如： —— 樣品處理有損失 、 色譜圖有問題 ， 或 —— 顯著偏離標準曲線 〔 該數據參與標準曲線回歸后 ， 計算 QC樣品或返算該點濃度時顯著偏離其標稱濃度 (配制濃度 )〕 —— 其余 應有至少 5個濃度點在標準曲線上 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 37 體內藥物分析 5. 加權最小二乘法 最小二乘法 —— 每個濃度點 絕對誤差 (yi－ yi’ )賦予同等的重要性 標準曲線上的高低濃度相差懸殊 (范圍達 102) —— 低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大 ， 難以滿足規(guī)定要求 加權最小二乘法 —— 回歸計算時增加一個 權重因子 (w) —— 各濃度的響應值與回歸值的相對離差平方和達到最小 式中 ， wi為標準曲線上第 i個濃度點的權重因子 ? ???????? ? 239。 39。i ii y yy? ? 2)39。(iii yyw? ? 2)39。( ii yy第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 38 體內藥物分析 1）回歸方程 (y = a + b x)參數的計算 ? ?? ? ?? ? ? ???????22biiiiiiiiiiiiixwxwwywxwyxww? ?? ? ?? ?? ? ??????222aiiiiiiiiiiiiiixwxwwyxwxwywxw?? ??iiiiiwxwyw ba 或， ? ?? ?? ? ?? ? ?????22//riiiiiiiiiiwywywwywbxa第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 39 體內藥物分析 2）權重因子的選擇 加權 —— 賦予低濃度點以更大的權重 在實際工作中的一般方法 —— 當 wi=1/(yi’ )2時 ， 則 —— 而 yi與 xi成正比 —— 所以 ， 令 wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取 wi=1/C2) 當 高濃度點 測量值的準確度 下降過大 —— 低濃度點權重過大 ， 降低 低濃度點的 權重 ， wi=k/xi ? ? 2)39。( iii yyw? ???????? ?239。39。iii y yy第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 40 體內藥物分析 標準曲線的 限度要求 藥代動力學或生物利用度研究 —— 標準曲線至少包括 5個濃度 (通常為 5～ 8個濃度 ,不包括零點 ) —— 最高濃度應高于達峰濃度 (Cmax)；最低濃度應低于 Cmax的10%～ 5%， 并應為方法的 LOQ(非 LOD) —— 回歸方程的截距應接近于零 —— 相關系數要求 ?≥(色譜法 )或 ≥(生物學方法 ) —— 若非線性 ， 可分為高低 兩個濃度區(qū)間 (每個區(qū)間不少于 5個濃度 )， 分別加權回歸 —— 如 20和 50、 100、 200 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 41 體內藥物分析 三、準確度 方法準確度 (accuracy) —— 系指用該方法 測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度 —— 應使用實際生物樣品測定 ， 但實際生物樣品的濃度是未知的所以 ， 通常使用模擬生物樣品測定 —— 一般用 相對回收率 (relative recovery， RR) 或 相對誤差(relative error， RE)表示 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 42 體內藥物分析 1. 測定法 取空白生物基質 （ 如血漿 ） 數份 ， 照標準曲線項下方法操作 ，用標準曲線計算 在標準曲線范圍內制備質控 (quality control， QC)樣品 —— 高 (接近上限 )、 中 、 低 (接近 LOQ) 3個濃度 —— 每一濃度至少 5個樣本 —— 與隨行的標準曲線同法測定 、 計算 ， 每個樣品分析測定 1次 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 43 體內藥物分析 2. 結果計算與限度要求 計算 —— 測定值 M (measured)平均值與理論濃度 (加入值 )A(added)比值 相對回收率 相對誤差 限度要求 —— 相對回收率應在 85%～ 115% (LOQ附近 80%～ 120%) —— RE在 177。 15% (LOQ附近為 177。 20%) ）（ %100?? AMRR ）（）（ %100%100 ????? RRA AMRE第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 44 體內藥物分析 四、精密度 方法精密度 (precision ) —— 系指每次測定結果與多次測定的平均值的 偏離程度 —— 表示該分析方法的 可重復性 (reproducibility) —— 反映分析方法的 可操作 性 ， 是方法驗證的基本要點之一 實際生物樣品的量有限 (如血漿 ， 一般為 ～ 2ml) —— 使用模擬生物樣品測定 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 45 體內藥物分析 1. 表示方法 方法精密度一般用標準偏差 (standard deviation， SD)或 相對標準偏差 (relative standard deviation， RSD)表示 SD= RSD= = —— 包括批內 (withinrun或 intraassay)RSD— 日內 (withinday) 和批間 (betweenrun或 interassay)RSD— 日間 (betweenday， daytoday) ? ?112?????nXXniii）（ %100?XSD? ?）（ %100112??????XnXXniii第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 46 體內藥物分析 2. 測定法 —— 分別測定法 (Ⅰ ) 照準確度項下方法 ， 取空白生物基質 (如血漿 )數份 ， 分別在同一批內和不同批間制備高 、 中 、 低 3個濃度的 QC樣品 ， 并分析測定 批內 RSD —— 每一濃度 5～ 6個樣品 ， 每個樣品測定 1次 ， 用隨行標準曲線分別計算 3個濃度及每 1濃度的 RSD 批間 RSD —— 每 1分析批內每一濃度制備 1個樣品 ， 每個樣品測定 1次；用隨行標準曲線計算 3個濃度 (每一濃度 5～ 6個分析批數據 )的 RSD 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 47 體內藥物分析 2. 測定法 —— 連續(xù)測定法 (Ⅱ) 若實際樣品測定所用的分析批次少于 5批 ， 也可進行 3個批次的連續(xù)分析 (每 1濃度的每 1批次為 5～ 6個樣本 )—— 方差分析法 批間 RSD = 批內 RSD = = (%)1001)((%)100112???????????????XIXXnXISSIiiA）（ %100(%)100 ?????????? XINSSSSXINSS Atote）（）（%100)(1 1212???????? ???????? ??XINXXnXXIiIiinjij第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 48 體內藥物分析 3. 限度要求 在藥代動力學和生物利用度研究中 對 ?g/ml級水平的 RSD一般應 ≤10% ng/ml級水平的 RSD一般應 ≤15% 在 LOQ附近 RSD應 ≤20%。 第四章 分析方法的建立與驗證 第三節(jié) 分析方法的驗證與要求 3/5/2023 49 體內藥物分析 五、定量限 方法定量限 (limit of quantitation， LOQ) —— 系指在保證具有一定可靠性 (準確度與精密度符合要求 )的前提下 ， 能測定出生物樣