【文章內容簡介】 層析。 ?按分離過程依據的理化性質分類 ：吸附層析、分配層析、離子交換層析、分子篩過濾層析、親和層析。 本本本 課課課 件件件 由由由 西西西 華華華 大大大 學學學 生生生 物物物 工工工 程程程 學學學 院院院 車車車 振振振 明明明 制制制 作作作 層析技術的應用 對于分子大小不等的化臺物，例如含多種蛋白質的混合液，宜用分子篩過濾分離；對于能溶于有機溶劑，難溶于水的化食物，常用吸附層析法分離；對于既溶于水也溶于有機溶劑的化合物，宜用分配層析分離；電解質混合物則宜用離交層析分離。 分配層析技術 分配層析是利用各組分的分配系數不同而予以分離的方法 。包括紙上層析、薄層層析、氣相層析。 分配系數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩相溶劑的濃度比值。 在層析條件確定后，分配系數是一個常數。以 K表示。 流動相中溶質的濃度固定相中溶質的濃度?K分配層析的基本原理 分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅膠、纖維素粉、淀粉、硅藻等）吸附著一種溶劑作為固定相 ，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。 另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可以沿固定 相流動 ，即流動相。溶質在流動相的帶動下流經固定相時，溶質在兩相之間連續(xù)動態(tài)分配。由于不同溶質的分配系數不同而分離。 紙上層析 紙上層析是以濾紙為支持物的一種分配層析。濾紙能吸收 22％－ 25％的水，其中 6％－ 7％的水以氫鍵與濾紙纖維上的羥基結合，難以脫去。所以 紙上層析是以濾紙纖維的結合水為固定相，以有機溶劑為流動相的層析技術 。由于各物質的分配系數不同，移動的速率也就不同，從而達到分離的目的。 紙層析的 Rf值 溶質在濾紙上移動的速率用 Rf值表示： Rf值決定于被分離物質在兩相間的分配系數以及兩相間的體積比，在同一實驗條件下，兩相的體積比是一個常數。所以 Rf值決定于分配系數。不同物質的分配系數不同， Rf值也不同，由此可以根據 Rf值的大小對物質進行定性分析。 紙層析的操作 盡可能純化，調節(jié) pH、 濃度 。 將樣品溶液用微量注射器點在原點。 在密閉層析缸內用溶液系統的蒸汽將濾紙飽和。 將濾紙的一端浸入溶劑中，讓其沿濾紙移動。 為了看清斑點，用顯色劑顯色。 計算 Rf值，進行定性。 剪洗比色、直接比色、面積測量。 離子交換柱層析 離子交換柱層析是用 離子交換劑作為水不溶性支持物兼固定相 ,裝成層析柱，用 不同 pH和不同離子強度的緩沖液作流動相 (洗脫液 )構成的柱層析技術。這是目前應用非常普遍的分離技術，無論實驗室還是生產領域都有廣泛的實用性。 離子交換劑 是含有若干活性基團的不溶性高分子物質。即在不溶性母體上引入若干可解離基團。 不溶性母體 ：苯乙烯樹脂、酚醛樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。 引入的活性基團，可以是酸性基團，也可以是堿性基團。 在不溶性母體上引入酸性基團，如磺酸基（ SO3 H）、 磷酸基（ PO3H2）、 亞磷酸基（ PO2H）、羧基（ COOH） 等時，可解離出 H+ ，與其它陽離子交換，這種離子交換樹脂屬于陽離子交換樹脂。 在不溶性母體上引入堿性基團，如季胺? N+（ CH3） 3? 、叔胺? N（ CH3） 2? 、仲胺? NHCH3? 、伯胺? NH2? 等含氨基的基團，可與OH結合后，與其它陰離子交換，屬于陰離子交換樹脂。 分配系數（平衡常數） 在一定條件下，離子交換劑所吸附離子濃度和在溶液中的離子濃度達到平衡時，兩者濃度之比叫做 分配系數（也叫 平衡常數 ）即： K值的大小決定樣品離子在柱內的保留時間。如果樣品中各離子的 K值差別足夠大，這些離子通過離子交換層析就可以得到分離。 陰離子只能被陰離子交換劑吸附，陰離子只能被陰離子交換劑吸附；親和力大的易吸附，難洗脫；親和力小的難吸附，易洗脫。 氨基酸的離子交換層析分離 當使用陽離子交換樹脂柱時，在pH2—3的條件下，各種氨基酸都帶正電荷，都能交換，上柱。與樹脂的靜電親和力大小依次為：堿性氨基酸（ A2+）＞ 中性氨基酸 (A+)＞ 酸性氨基酸 (A177。 )。 當用緩沖液洗脫時，隨 pH由低到高，氨基酸洗脫流出的次序大體上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，最后是堿性氨基酸。 同種性質的氨基酸， R基團與樹脂間親和力小者先流出，大者后流出。 離子交換層析技術的自動化 返回 蛋白質的一級結構 蛋白質分子是蛋出質的具有完整生物功能的最小結構單位。 1952年丹麥人 LinderstromLang最早提出蛋白質的結構可以分成四個層次 : ? 一級結構： 氨基酸序列 ? 二 級結構： α 螺旋， β 折疊 ? 三 級結構： 所有原子空間位臵 ? 四 級結構： 蛋白質多聚體 一級結構又叫初級結構、基本化學結構或共價結構。 1969年國際純粹與應用化學聯合會 (IUPAC)定義為：一級結構即肽鏈中的氨基酸順序。 一級結構是高級結構的化學基礎，也是認識蛋白質分子生物功能、結構與生物進化的關系、結構變異與分子病的關系等許多復雜問題的重要基礎。 研究一級結構需要闡明的內容包括： ?（ 1）蛋白質分子的多肽鏈數目。 ?（ 2）每條肽鏈的末端殘基種類。 ?（ 3）每條肽鏈的氨基酸順序。 ?（ 4）鏈內或鏈間二硫鍵的配臵等。 多肽鏈 氨基酸通過肽鍵 連接起來的鏈狀物根據其長短稱為寡肽、短肽、多肽和蛋白質，很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。 研究蛋白質的 一級結構 ，就是要將氨基酸的排列順序搞清楚。 四十年代起，許多人不遺余力從事蛋白質的一級結構研究。 一級結構研究史上的兩個第一 ?1954年英國生化學家 Sanger報道了胰島素的一級結構，是世界上第一例確定一級結構的蛋白質。 Sanger由此1958年獲 Nobel 化學獎。 ?1965年我國科學家完成了結晶牛胰島素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白質。 多肽鏈的結構 一級結構中的二硫鍵 分析一級結構的一般程序 一級結構的分析是一項非常細致而又復雜的技術上作，基本工作程序是： （ 1）將蛋白質純化，測定末端組成。 （ 2）拆分蛋白質分于并將多肽分離純化。 （ 3）用酶法或化學方法進行專一性切割，得到系列長短不一的肽段。 （ 4）將肽段分離，通過末端分析方法測定各肽段的氨基酸順序。 （ 5）根據二肽段的順序重疊關系確定各個肽段的銜接順序。排出完整多肽鏈的氨基酸順序。 （ 6）確定二硫鍵的位臵。 Sanger試劑 (FDNB)標記 N末端 ABCDE ↓ *ABCDE ↓ *A， *AB， *ABC， *ABCD， *ABCDE ↓ *A,*A+B,… … *A+B+C+D+E↓ *A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 結論 ： A B C D E 一級結構與蛋白質功能的關系 一級結構中，有的部位保守性很強，既不能缺失，也不能更換，否則就會喪失活性；有的部位則可以改變，切除或更換別的殘基都不影響生物活件；還有的部位必須切除之后，蛋白質分子才顯活性。不同部位的殘基對功能的影響，實質是影響了蛋白質分子特定的空間構象的形成。 許多先天性疾病是由于某一重要的蛋白質的一級結構發(fā)生了差錯引起的。如血紅蛋白 β 亞基 6 位 Glu被Val代替（基因突變），即表現為鐮刀狀貧血，為世上最常見的血紅蛋白病。 比較不同生物細胞色素 C的一級結構可以幫助了解物種間的進化關系，物種間越接近，則細胞色素 C的一級結構越相似 牛胰島素分子的激活： 天然活性肽 除了蛋白質水解可以產生長短不等的肽段之外，生物體內還有很多游離存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽屬于激素類，如催產素、加壓素等都是九肽。 返回 蛋白質的空間結構 所謂蛋白質分子的空間結構是指分子的 構象 而言。構象與構型都是立體化學結構概念，但含義不同。 構型是由于化合物分子中某一不對稱碳原子上四種不同的取代基團（或原子）的空間排列所形成的一種光學活性立體結構。 一個不對稱碳原子只能形成兩種不同的構型。分子從一種構型變?yōu)榱硪环N構型，例如從 D丙氨酸變?yōu)?L丙氨酸，必須發(fā)生共價鍵的變化（斷裂和另生成）。 構象是分子內所有原子或原子團的空間排布所形成的 —種立體結構。 這類立體結構不需要共價鍵斷開，只要分產中發(fā)生 C－ C單鍵的轉動就能從一種構象變?yōu)榱?—種構象。如此說來，蛋白質分子該有無數構象了，其實不然。研究證明，天然蛋白質分子都有與其生物活性相關的一種或少數幾種特定的構象，這種天然構象相當穩(wěn)定。 —定條件下，將蛋白質分子從細胞中分離出來，仍能保持其天然構象和生物活性。 維系蛋白質分子構象的化學鍵 蛋白質的二級結構 二級結構： 多肽鏈中各原子在局部空間或一段肽鏈的氨基酸殘基的空間排布方式。 為主鏈構象，不涉及側鏈構象。包括 α 螺旋、 β 折疊以及 β 轉角，這些主鏈基本構象都是以酰胺平面（或稱肽鍵平面、肽單元）為基本結構單位，有規(guī)則的盤曲而成的。也存在部分無規(guī)則卷曲。 肽鍵平面 肽鍵平面 肽鏈中的肽鍵平面 兩個肽平面以一個 Cα 為中心發(fā)生旋轉 蛋白質 α 螺旋結構 ?右手螺旋 (順時針 )。 ?肽鏈的主鏈形成緊密的螺旋 ,側鏈伸向外側，每一圈包含 ,每個殘基跨距為 ,螺旋上升一圈的距離 (螺距 )為 =，環(huán)內原子數 13。 ?螺旋通過氫鍵維持穩(wěn)定。第一個肽鍵的 NH和第四個肽鍵的 CO形成氫鍵 ,第 n個肽鍵的 NH和第 n+3個肽鍵的 CO形成氫鍵。氫鍵取向與主軸基本平行。 α 螺旋結構形成的限制因素 ?凡是