基因工程第三章2：操作技術(shù)(編輯修改稿)
2024-10-08 21:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 1988年， Chamberlain研究表明 PCR可以同時(shí)擴(kuò)增人類肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因多個(gè)基因座以來(lái)，多重 PCR技術(shù)得到研究人員的廣泛關(guān)注，并且已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一種通用技術(shù)。如今，多重 PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于病原體鑒定、性別篩選、連鎖分析、法醫(yī)研究、模板定量和遺傳疾病診斷之中。 多重 PCR Chapter three ?多重 PCR（ multiplex polymerase chain reaction， MPCR）也稱為復(fù)合 PCR，是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)之上進(jìn)行改進(jìn)從而發(fā)展起來(lái)的一種新型的 PCR擴(kuò)增技術(shù)，多重 PCR技術(shù)的基本原理與常規(guī)的 PCR技術(shù)相同。 ?多重 PCR技術(shù)主要有兩種形式：一、將多條引物和多個(gè)模板 DNA混合在同一個(gè)反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，常用于突變?nèi)笔z測(cè)、多態(tài)分析等；二、將多條引物和單一的模板 DNA混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片段，常用于對(duì)超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增。 Chapter three ? 多重 PCR的優(yōu)點(diǎn)：①高效性，在同一 PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，且所需模板或樣品量極少，應(yīng)用一滴血就可檢測(cè)多種病原體。②系統(tǒng)性，多重 PCR很適宜對(duì)癥狀相同或容易污染相同食品的一組病原菌進(jìn)行分析，即適宜對(duì)成組病原體進(jìn)行檢測(cè)，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無(wú)芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時(shí)檢測(cè)③經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開(kāi)支，為臨床或食品安全檢測(cè)提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息。 ? 多重 PCR的不足：①靈敏性和檢測(cè)的特異性低 ②需要優(yōu)先擴(kuò)增某一特定片段 ③容易形成引物二聚體。多重 PCR要求不同的引物能在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行各自的特異性擴(kuò)增，但是它的體系建立和條件優(yōu)化過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以在一定程度上限制了該方法的推廣應(yīng)用。 Chapter three ?面臨的問(wèn)題： 在多重 PCR的反應(yīng)體系中，由于涉及到的引物比較多，因此比較容易造成引物二聚體、錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象，從而降低擴(kuò)增反應(yīng)的效率。所以在建立一個(gè)多重 PCR反應(yīng)體系的時(shí)候，需要對(duì)設(shè)計(jì)的引物，反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)條件等進(jìn)行反復(fù)的摸索，并進(jìn)行優(yōu)化。 Chapter three PCR： ?常規(guī) PCR只能擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的 DNA區(qū)段，但有時(shí)我們想知道基因之外的兩側(cè)未知 DNA序列，這樣就出現(xiàn)了反向 PCR。 ? 反向 PCR首先將 DNA用限制性內(nèi)切酶切割，切割要保持已知序列兩端有未知序列，進(jìn)行環(huán)化，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增。產(chǎn)物是已知序列以外的序列。 Chapter three － RFLP(restriction fragment length polymorphism) ? 是一種借助于限制性內(nèi)切酶
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