【文章內(nèi)容簡介】 ? 搖瓶種子制備 ? 某些產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將菌絲或孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐，這就是搖瓶種子。 ? 搖瓶培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與種子罐相似。 ? 種子培養(yǎng)基要求比較豐富和完全，易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃，子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高，更接近于種子罐的培養(yǎng)基配方。 子瓶培養(yǎng) 母瓶培養(yǎng) 孢子菌絲 種子罐 如：灰色鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素 卡那鏈霉菌生產(chǎn)卡那霉素 35 ? 種子罐種子制備 ? 種子罐種子制備是指 菌種室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。 ? 種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，在工廠歸發(fā)酵車間管理，因此稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。 ? (1) 種子罐的作用： ? 使有限數(shù)量的孢子 (菌體 )發(fā)芽、生長、并繁殖成大量的菌 (絲 )體，滿足發(fā)酵罐內(nèi)菌體生長和產(chǎn)物合成的需要。 ? (2) 種子進(jìn)入種子罐方式 ： ?孢子進(jìn)罐法 ?搖瓶菌絲進(jìn)罐法 36 ? 孢子進(jìn)罐法： 是將固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的孢子制成孢 子懸浮液直接接入種子罐的方法。 優(yōu)點： ① 可減少批與批之間的差異，穩(wěn)定生產(chǎn)； ② 工藝過程簡單，一次可以制備大量的孢 子，便于控制孢子質(zhì)量。也易于保存； ③ 操作簡便、不易污染雜菌。 ? 搖瓶菌絲進(jìn)罐： 定義你們自己做。 優(yōu)點： 對于生長、發(fā)芽緩慢的菌種，可以縮短種 子在種子罐內(nèi)的培養(yǎng)時間， 缺點： ① 現(xiàn)制現(xiàn)用，菌絲不易保存； ② 批與批之間差異，易造成生產(chǎn)波動； ③ 孢子制備工藝拖長，增加染菌機(jī)會。 菌種 入罐 方法 母斜面孢子入罐 子斜面孢子入罐 母瓶菌絲入罐 子瓶菌絲入罐 獲得好的 發(fā)酵結(jié)果 37 ? (3) 種子罐級數(shù)的確定 ? 種子罐 制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)稱作 種子罐級數(shù) 。 ? 一級種子： 把孢子瓶中的孢子或搖瓶菌絲接入到種子罐中，孢子發(fā)芽并繁殖成的大量菌體 (絲 )。 ? 二級種子： 是指把一級種子接入到體積更大的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成更多的菌體 (絲 ) 。 ? 一級發(fā)酵： 采用直接將孢子或菌絲體接入罐中發(fā)酵，稱為一級發(fā)酵。通常在進(jìn)行小型罐（ 5~500L）實驗時。 ? 二級發(fā)酵： 一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵稱為二級發(fā)酵。 ? 依此類推：發(fā)酵級數(shù) = 種子罐的級數(shù) + 1。 38 ? 種子罐的級數(shù)確定主要決定于 ① 種子的傳代穩(wěn)定性； ② 孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度； ③ 孢子瓶中孢子的密度； ④ 發(fā)酵罐的容積和 接種量的要求。 ? 細(xì)菌： 生長快 ， 種子用量比例少 ， 級數(shù)也較少 ， 二級發(fā) 酵即可； ? 霉菌： 生長較慢 ， 如青霉菌 ， 采用三級發(fā)酵； ? 放線菌： 生長更慢 ， 采用四級發(fā)酵； ? 酵母 ：比細(xì)菌慢 ， 比霉菌 、 放線菌快 ， 通常用二級發(fā)酵 。 39 ? 谷氨酸生產(chǎn)中，采用茄瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于 32℃ 培養(yǎng) 7~10h，菌體濃度達(dá) 108~109個 /mL，即可接入發(fā)酵罐作為種子。 ? 青霉素生產(chǎn)菌種，生長較慢，其孢子液接入一級種子罐擴(kuò)培于 27℃ 培養(yǎng) 40h，孢子發(fā)芽，長出短菌絲，再移至含有新鮮培養(yǎng)基的二級種子罐，于 27℃ 培養(yǎng)10~24h，菌絲迅速繁殖，獲粗壯菌體，即可移至發(fā)酵罐作為種子。 ? 產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌，產(chǎn)孢子能力弱、孢子發(fā)芽慢，先將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖床上培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為 種子罐 種子。 40 ? 確定種子罐級數(shù)需注意的問題 ? 種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少變異和染菌機(jī)會； ? 但種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會； ? 雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。 ? 如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 41 ? 種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進(jìn)行的重要因素之一。種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及判斷 ? 種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)因產(chǎn)品、菌種及工藝條件不同而有所不同。生產(chǎn)上 常用的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： (1) 細(xì)胞或菌體： 看顏色、聞氣味；顯微鏡下觀察菌體形態(tài)；測 定 菌體濃度和粘度等。 ? 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； ? 霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況良好。 ? 菌體生長階段（種齡）：處于對數(shù)生長期后期， 菌體量未達(dá)到高峰。 離心沉淀法、光密度法、細(xì)胞記數(shù)法 42 分批發(fā)酵條件下，黃色短桿菌 TK0303的菌體形態(tài)變化 5L罐延遲期（ 4h） 5L罐對數(shù)期（ 32h） 5L罐穩(wěn)定期（ 48h） 5L罐衰亡期（ 68h） 搖瓶衰亡期（ 72h） 43 ? 產(chǎn)黃青霉在 青霉素發(fā)酵時，菌絲體的生長分 6個時期， ? Ⅰ 期：分生孢子發(fā)芽。孢子先膨脹再形成小的芽管，此時原生質(zhì)未分化，具有小空孢。 ? Ⅱ 期：菌絲繁殖，原生質(zhì)嗜堿性很強，在 Ⅱ 期末有類脂肪小顆粒。 ? Ⅲ 期：形成脂肪粒，積累貯藏物。原生質(zhì)嗜堿性仍很強。 ? Ⅳ 期 脂肪粒減少，形成中、小空孢子。原生質(zhì)嗜堿性弱。 ? Ⅴ 期 形成大空孢子其中含有一個或數(shù)個染色的大顆粒。脂肪粒消失。 ? Ⅵ 期：細(xì)胞內(nèi)看不到顆粒，并出現(xiàn)個別自溶的細(xì)胞。 ? 其中 I~Ⅳ 期初稱菌絲生長期。產(chǎn)生青霉素較少，而菌絲濃度增加很多。 Ⅲ 期適于作發(fā)酵用種子。 Ⅳ ~Ⅴ 期稱青霉素分泌期，此時菌絲生長趨勢漸減弱。大量產(chǎn)生青霉素。 Ⅵ 期即菌絲自溶期，菌體開始自溶。 44 放線菌 菌絲團(tuán) 霉菌菌絲 45 ? 生化指標(biāo)： 種子液的糖、氮、磷的含量和 pH變化。 ? 產(chǎn)物生成量： 在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。 ? 特異性 酶活力： 種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)，如土霉素即可通過測定種子液中淀粉酶活力判斷種子好壞。 ? 無雜菌 污染 。 46 ? 二、影響種子質(zhì)量的因素及控制 ? 種子質(zhì)量的優(yōu)劣，主要取決于菌種本身的 遺傳特性和 培養(yǎng)條件 兩個方面。 ? 孢子質(zhì)量、 ? 培養(yǎng)基、 ? 培養(yǎng)條件、 ? 種齡 ? 接種量 47 培養(yǎng)基： ? 選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的營養(yǎng)成分，使菌絲粗壯并具有較強的活力； ? 要易于被菌體直接吸收和利用，如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等 ； ? 營養(yǎng)成分要 比發(fā)酵培養(yǎng)基 適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高； ? 組分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近 ， 這樣種子移入發(fā)酵罐后能比較容易適應(yīng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件 (馴化 )。 ? 種子培養(yǎng)基的 pH要比較穩(wěn)定， 以適合菌的生長和繁殖 。 48 ? 谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分表 用途 成分（ %） 規(guī)模 保藏 牛肉膏 1，蛋白胨 1，瓊脂粉 ， 無機(jī)鹽 斜面 添加 ，其余同上 一級 口服葡萄糖 3，玉米漿 ，尿素 ， 1200 ml /5000 ml 二級 玉米淀粉雙酶糖 ， 玉米漿 ，甘蔗糖蜜 ，尿素 ，無機(jī)鹽等 / 2 m3 三級 玉米淀粉雙酶糖 ， 玉米漿 ，甘蔗糖蜜