【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 10kb的質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)采用堿性SDS法。（2）分離細(xì)菌基因組均比較大，如大腸桿菌的染色體約有4700 kb長(zhǎng)，在處理細(xì)胞過(guò)程中斷裂成不同長(zhǎng)度的雙鏈DNA片段。當(dāng)溶液的pH值調(diào)節(jié)到大于12時(shí)，雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA雙鏈分離成單鏈；而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅部分氫鍵被破壞，只是部分雙鏈解離成單鏈。再將溶液的pH值調(diào)回中性時(shí)，單鏈DNA互相纏繞并且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍然是小分子，通過(guò)離心很容易將兩者分開(kāi)。達(dá)到分離的目的。（3）純化細(xì)胞裂解液中的雜質(zhì)除了染色體DNA外，還有各種細(xì)胞壁、膜的碎片、各種酶與其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)以及RNA等。純化步驟應(yīng)有針對(duì)性地將它們?nèi)コ?。離心去除各種細(xì)胞碎片；用酚處理去除蛋白質(zhì)，包括各種酶；用RNA酶處理去除RNA等。酚是一種作用非常強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能非常有效地是蛋白質(zhì)變性進(jìn)而去除。氯仿有強(qiáng)烈的溶脂性，可去除脂質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)。酚/氯仿可節(jié)約重蒸酚。氯仿能將微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉，否則微量的酚對(duì)于以后的酶切、轉(zhuǎn)化等過(guò)程都會(huì)產(chǎn)生不利影響。抽提完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法將它們除去。乙醇沉淀的特點(diǎn)是能在濃縮DNA的同時(shí)更換整個(gè)緩沖系統(tǒng)，但DNA會(huì)有一定的損失。由于雜質(zhì)不易在乙醇中沉下，沉淀過(guò)程可在0℃進(jìn)行。乙醇較異丙醇易揮發(fā)，沉淀得到的DNA比較干凈。鹽等雜質(zhì)易在異丙醇中沉下。沉淀DNA時(shí)加入鹽類(lèi)的目的是中和鏈上的電荷，使DNA易于形成沉淀。該方法抽提質(zhì)粒主要的試劑為溶液I、II和III，其在抽提質(zhì)粒DNA中的作用如下：溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl組成。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA；EDTA的作用是絡(luò)和掉Mg2+等二價(jià)金屬離子，防止DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用；Tris?Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍。溶液II：由SDS與NaOH組成。SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性；NaOH(pH12)的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液III：由KAc與HAc組成。能中和溶液II的堿性，使染色體DNA復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DNA復(fù)性。K+離子會(huì)與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會(huì)與蛋白質(zhì)SDS形成相互纏繞的大分子物質(zhì)，很容易與小分子的質(zhì)粒DNA分離，此外，高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成。 煮沸法質(zhì)粒DNA的抽提煮沸裂解法是將細(xì)菌懸浮在含有能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了能破壞細(xì)菌外壁，還有助于解開(kāi)DNA鏈的堿基配對(duì)，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈彼此不會(huì)分離，這是因?yàn)樗鼈兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度下降后閉環(huán)DNA的堿基又各就各位，形成超螺旋分子。離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)，就可以從上清中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法對(duì)于小于15kb的小質(zhì)粒抽提非常有效。但對(duì)于那些經(jīng)變性劑，溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用該法。這是因?yàn)樘妓衔锖茈y除去，會(huì)抑制限制酶和聚合酶的活性。大腸桿菌菌株HB101及其衍生菌株（其中包括TG1）能產(chǎn)生大量的碳水化合物，不適用于煮沸法裂解。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以快速省時(shí)獲得一定量的質(zhì)粒DNA，用于酶切鑒定?；蚪MDNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交（包括RFLP）及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性，可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達(dá)到提取的目的。在提取過(guò)程中，染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作，如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過(guò)程要輕緩，以保證得到較長(zhǎng)的DNA。一般來(lái)說(shuō)，構(gòu)建基因組文庫(kù)，初始DNA長(zhǎng)度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析，DNA長(zhǎng)度可短至50kb，在該長(zhǎng)度以上，可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段（20kb以下），并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段（一般2kb以下）。不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同，不同種類(lèi)或同一種類(lèi)的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法，以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類(lèi)物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用，因此用富含這類(lèi)物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí)，應(yīng)考慮除去多糖和酚類(lèi)物質(zhì)。目前針對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞均開(kāi)發(fā)除了相應(yīng)的抽提試劑盒。常規(guī)實(shí)驗(yàn)中從細(xì)菌基因組上PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，一般所用的DNA量較少，可以采用較簡(jiǎn)單的沸水浴裂解法制備少量的DNA。在短時(shí)間的熱脈沖下，細(xì)胞膜表面會(huì)出現(xiàn)一些孔洞，此時(shí)就會(huì)有少量的染色體DNA從中滲透出來(lái)，然后離心去除菌體碎片，上清中所含的基因組DNA即可用于PCR模板。而對(duì)于大量的基因組DNA制備（如Southern Blotting，需大量基因組），可采用試劑盒抽提。 試劑與器材1. 試劑 （1）溶液I 堿溶法抽提質(zhì)粒DNA 葡萄糖 50mM TrisHCl 50mM EDTA 10mM 溶菌酶 5mg/mg 使用前加入 （2）溶液II 堿溶法抽提質(zhì)粒DNA NaOH SDS % 使用前用母液配制 （3）溶液III（ 3M KAc） 堿溶法抽提質(zhì)粒DNA 5mol/L乙酸鉀 60ml 冰乙酸 （4）苯酚飽和溶液苯酚溶解后用10mM Tris（） （5）氯仿 （6）異丙醇 （7）STET溶液 沸水浴抽提質(zhì)粒DNA 蔗糖 8% TritonX100 5% TrisHCl () 50mM EDTA () 50mM mg/ml （8）Buffer A 大腸桿菌染色體DNA的制備 TrisHCl () 10mM EDTA () 20mM 使用前加入溶菌酶至終濃度5 mg/ml （9）SDS（10％） （10）NaOH（2M） （11）NaCl（5M） （12）RNaseA（10mg/ml） 固體粉末溶于無(wú)菌水后煮沸10分鐘，后冷卻并分裝于小管中20℃保存 （13）冰乙醇（70％） 可用95％乙醇配制，20℃保存?zhèn)溆?. 器材 （1）eppendorf管，槍頭 （2）移液器 （3）水浴鍋 （4）離心機(jī) （5）搖床3. 菌種 （1） JM83 F’，ara, D(lacproAB)，rpsL，(Strr)，F(xiàn)80 DlacZDM15 （2）pMDphoA/JM83 沸水浴法快抽大腸桿菌質(zhì)粒DNA（1）在Eppendorf管中加入110ml的STET（使用前加入溶菌酶至終濃度為5mg/ml）溶液，挑入米粒大小的菌團(tuán)，充分懸浮并混勻。（2）上述菌體懸浮液沸水煮20秒。（3）迅速放置于常溫下15 000rpm離心15分鐘。（4）用牙簽挑去菌體碎片（白色沉淀），在上清液中加入100ml的異丙醇（注意不同樣品管中的溶液平衡），充分混勻后15 000rpm離心15分鐘。（5）棄上清液，沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗滌上述所得DNA樣品，完畢后棄上清，管子倒扣10S左右，然后將DNA沉淀涼干。（6）沉淀涼干后用50ml無(wú)菌重蒸水溶解，樣品可取5ml酶切電泳分析或待用。 堿溶法制備大腸桿菌質(zhì)粒DNA（1），于臺(tái)式高速離心機(jī)中以15 000rpm，常溫離心30秒，棄去上清液并將離心管倒扣在濾紙上。（4管/組)（2）在離心管中加入100ml溶液I懸浮菌體，渦旋振蕩，以充分懸浮菌體成均勻懸浮液。（3）加入200ml溶液II，扣上離心管蓋，立即輕輕混勻（來(lái)回顛倒數(shù)次），至溶液幾乎澄清，成淡黃色透明粘液狀。（4）打開(kāi)離心管蓋，加入150ml溶液III，輕輕混勻（來(lái)回顛倒數(shù)次），看到淡黃色消失，有大量白色沉淀生成，然后離心。（5）常溫15 000rpm離心10分鐘，小心吸取上清液于另一離心管中。注意，不要把白色絮狀物混入上清液中。（6）清液中加入等體積的苯酚飽和溶液：氯仿混合溶液（1:1）（各200ml），充分混勻，常溫15 000rpm離心10分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。注意不要將下層有機(jī)相混入上清液中。（7）在上清液中加入20℃冷凍的異丙醇600ml，充分混勻，常溫15 000 rpm離心10分鐘。（8）小心傾去上清液，注意避免把離心管底的白色DNA沉淀也隨同上清倒掉。加入400ml 75%的冰乙醇，再15000rpm離心1min，傾去上清，倒扣離心管于濾紙上，稍許涼干。（9）加入100ml無(wú)菌重蒸水溶解質(zhì)粒DNA，可在37℃保溫5~10分鐘。(100ml/管，4管)（10）合并于一管，加入2ml RNase，37℃保溫30分鐘，取5ml電泳檢查消化徹底否。（以電泳前端無(wú)RNA條帶為準(zhǔn)）（11）RNase消化完全后加入等體積的苯酚飽和溶液：氯仿混合溶液（1:1）（各300ml），充分混勻，4℃，15 000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管。（12）, KAc（約40ml），400ml的–20℃冷凍的異丙醇，充分混勻，4℃，15 000 rpm離心20分鐘。（13）用400ml 75%的冰乙醇洗滌一次，再15000rpm離心1min，傾去上清，倒扣離心管于濾紙上，稍許涼干，待用。（14）如需定量或檢測(cè)制備的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量，可取適量質(zhì)粒DNA進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定OD260nm和OD280nm值，計(jì)算OD260nm/OD280nm的比值。質(zhì)粒雙鏈DNA量可以1 OD260nm＝50mg/ml計(jì)算。OD260nm/。 沸水浴制備染色體DNA（1）在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O，挑入米粒大小的菌團(tuán)，充分懸浮并混勻。（2）上述菌體懸浮液沸水煮20秒。（3）迅速放置于常溫下15 000rpm離心10分鐘。（4）用牙簽挑去菌體碎片（白色沉淀），上清待用。 大腸桿菌中染色體DNA的抽提（1）大腸桿菌一級(jí)瓶培養(yǎng)過(guò)夜，以10%的接種量接二級(jí)瓶培養(yǎng)4～5小時(shí)后，培養(yǎng)物以50ml/管離心收獲（8 000 rpm，5min，4℃）。（2）菌體沉淀中加入10ml BufferA，旋渦振蕩混勻，37℃保溫30分鐘。（3）取出后加入10% SDS至最終濃度為1%，輕輕混勻，37℃保溫30分鐘澄清即可。（4）取出后加入20mg/ml的ProK至最終濃度為5mg/ml，60℃保溫1小時(shí)。（染色體DNA結(jié)合蛋白的消化）（5）取出后加入預(yù)冷的5M NaCl至最終濃度為1M，混勻后冰浴30分鐘（溶液要混合成為均相，并且冰浴要充分，時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)）。（6）取出后4℃，15 000 rpm離心30分鐘。（離心前樣品管要進(jìn)行平衡，以免離心機(jī)受損）（7）在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液，混勻，室溫下12,000rpm離心30分鐘。（8）在上清液中加入10ml氯仿，混勻，室溫下12 000rpm離心30分鐘。（9）取上清液，加一倍量異丙醇沉淀DNA，冰浴放置30分鐘，15 000rpm離心30分鐘。（10）75% 冰乙醇洗滌5分鐘。（11）晾干后，用300ml無(wú)菌雙蒸水溶解染色體DNA，在37℃水浴中放置30分鐘。（12）用2～( )。（13）沉淀洗滌，抽干后用ddH2O溶解，分裝并保存于20℃。4 DNA的連接摘要 本單元主要介紹載體和供體DNA連接的影響因素，連接中兩種DNA投入量的確定原則和，學(xué)會(huì)根據(jù)不同克隆要求設(shè)計(jì)連接反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)原理 DNA的連接策略質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb)且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆，從原理上說(shuō)是很簡(jiǎn)單的，先用限制性?xún)?nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段，然后體外使兩者相連接，再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：（1）互補(bǔ)性粘性末端的連接單一限制性?xún)?nèi)切酶或兩種限制性?xún)?nèi)切酶（為同尾酶，如BamHI和BglII）分別處理載體和外源DNA，得到的粘性末端為互補(bǔ)性突出末端，在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物，且正反兩種連接方向都可能有。為了降低載體的自身環(huán)化，使正確的連接產(chǎn)物數(shù)量達(dá)到最高水平，一般載體DNA和外源DNA的分子數(shù)比（濃度比）為1：3～1：10之間。同時(shí)，為了最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，還可將載體DNA的539。磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉，防止其自身環(huán)化。而帶539。端磷酸的外源DNA片段可有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開(kāi)環(huán)分子。（2）非互補(bǔ)粘性末端的連接用兩種不同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這DNA重組中最容易克隆的DNA片段。一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。該種粘性末端的連接載體DNA和外源DNA的分子數(shù)比（濃度比）通常為為1：1。（3）平頭末端的連接是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇（PEG 8000）以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無(wú)法相互匹配，則可以在線(xiàn)狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭（linker）或銜接頭（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的