第六章-獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)--苯并咪唑類(編輯修改稿)
2024-09-01 15:47 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 于 CAM、 TCB和 TCB代謝產(chǎn)物 ,它們都有兩個(gè)或更多的pKa,因此溶劑提取時(shí) ,控制溶液的 pH值尤為重要 。 ? 三氯苯達(dá)唑 (TCB)、三氯苯達(dá)唑硫化物 (TCBSO)、 TCBSO2和 CAM分別在 ~、 ~、 ~~ ,因此 ,只有當(dāng) ~ ,所有這些分子都呈 中性 。 ? 大部分苯并咪唑類藥物在 pH8時(shí)都呈中性 ,當(dāng)預(yù)測(cè)某些苯并咪唑類藥物的 pKa約為 8時(shí) ,這時(shí)欲對(duì)這些組分同時(shí)提取變得相當(dāng)困難。 ? 但也有例外 ,如 MBZNO2和 OXI在 pH ,以非電離形式存在。 水解 ? 肝 和 奶 樣中苯并咪唑類藥物與 蛋白結(jié)合率較高 ,不易被有機(jī)溶劑提取 ,可先將樣品 水解 后再提取游離的藥物。 ? 常用的水解方法有 酸水解 和 酶水解 兩種。 ? 酸水解 通常使用無(wú)機(jī)酸 ,例如用 4moL/L鹽酸于80~110℃ ,在 1~4h即可完成水解。 ? 酸水解具有簡(jiǎn)便、快速、水解完全等優(yōu)點(diǎn) ,因而被廣泛采用。 酶水解 ? 酶水解 通常使用 β葡糖苷酸酶 或 芳基硫酸酯酶 ,前者可專一地水解葡萄糖醛酸苷結(jié)合物 ,后者可水解硫酸酯結(jié)合物。 ? 由于肝樣中通常存在上述兩種結(jié)合物 ,常使用 β葡糖苷酸酶 /芳基硫酸酯混合酶 ,控制~,于一定溫度下孵育 18~72h。 ? 與酸水解相比 ,酶水解比較溫和 ,一般不會(huì)引起藥物的分解 ,但有時(shí)水解不完全和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高是該法的缺點(diǎn)。 ? Tocco等發(fā)現(xiàn) TBZ在 尿 和 奶 中的代謝產(chǎn)物主要是 5OHTBZ與葡糖苷酸和硫酸酯結(jié)合物 ,結(jié)合物用 β葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸 (6mol/L鹽酸回餾 1h)水解 ,釋放出游離的 5OHTBZ。 ? Chuckwudebe等對(duì) TBZ在 蛋雞 和 奶牛 中代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究 ,發(fā)現(xiàn)結(jié)合物主要是 硫酸酯結(jié)合物 。 ? Markus等對(duì)肝樣中的 ABZ及其相關(guān)代謝物的結(jié)合物用酸解方法進(jìn)行水解 ,釋放出游離的 ABZNH2SO2。 ? Coulet等對(duì)組織中的 TBZ蛋白結(jié)合物用 堿解方法水解 。 提取及凈化 ? 液 液萃取 (LLP)是提取苯并咪唑類藥物的 最常用方法 ,通常將水性溶液調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)?pH值 ,用水不相溶的有機(jī)溶劑提取。 ? 用酸溶液提取時(shí) ,即包括了樣品的水解過(guò)程。 ? 由于苯并咪唑類藥物的極性和 pKa差異很大 ,因此 多殘留提取相當(dāng)困難 ,即使對(duì)單一藥物 ,母藥及其代謝產(chǎn)物的同時(shí)提取亦難。 例如 ? MBZ及其兩個(gè)代謝產(chǎn)物 MBZOH和 MBZNH2,由于MBZ和 MBZNH2呈堿性 ,pKa分別是 ,在 pH時(shí) ,這兩種化合物不被電離 。MBZOH含酸性的 OH,其pKa為 ,在 pH。因此 ,溶液只有在~ ,所有化合物不被電離 ,呈中性 ,這時(shí)可用極性溶劑 (如 :乙腈、甲醇、水 乙腈、水 甲醇等 )來(lái)提取。 (1)血漿、血清或其他生物液體 ? 生物體液樣品中的苯并咪唑類可用 有機(jī)溶劑提取 ,直接進(jìn)樣分析。 ? Bogan等將血漿樣品調(diào)節(jié)至 ,用乙酸乙酯來(lái)提取FBZ、 OFZ和 ABZ。 ? Hoaksey等將血漿樣品用乙腈脫蛋白 ,再用二氯甲烷提取ABZ和 ABZSO。 ? Alvinerie用乙酸乙酯提取血漿中 TCB、 TCBSO和 TCBSO2,以及 TBZ和 5OHTBZ,直接用 HPLCUV測(cè)定。 ? Allan等將血漿樣品用酸性溶液稀釋后過(guò) C18小柱 ,依次用20mL水、 +水 (40+50)和 ,最后用 ,甲苯達(dá)唑及其代謝物的回收率大于80%。 ? Hennessy等將這一方法用于膽汁中 TCB的提取 ,但樣品過(guò)柱前先用乙酸乙酯提取 ,后來(lái)也用于血漿樣品中 ABZ的提取。 ? 自動(dòng)萃取儀 具有省時(shí)、省力、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn) ,應(yīng)用日趨廣泛。 ? Rouan等采用自動(dòng)萃取儀、 C18固相萃取柱提取 /凈化血漿樣品中 TCB,回收率可達(dá)到 90%以上。 (2)組織 ? 動(dòng)物組織中的苯并咪唑類提取 一般用有機(jī)溶劑 ,并經(jīng) LLP和 SPE凈化。 ? 有人采用 LLP和 SPE相結(jié)合方法進(jìn)行凈化 ,用 HPLCUV檢測(cè)。也有人采用 LLP的單一凈化方法 ,用選擇性高的熒光檢測(cè)或 LCMS/MS檢測(cè)。 ? 雖然 LLP凈化方法選擇性較差 ,但適合于苯并咪唑類的多組分提取 ,而用復(fù)雜的凈化方法可能回收率較低。 ? Brandon等用二甲亞砜 水 (10+90)來(lái)提取肝組織中的TBZ,在 ELISA測(cè)定前用 PBS稀釋。 ? Brandon等采用類似的方法 ,用二甲亞砜 水 (10+90)提取肝組織中 11種苯并咪唑類殘留 ,包括水溶性低的 FBZ。 ? Marti等用乙腈提取肌肉、肝臟、腎臟組織中 8種苯并咪唑類殘留 ,提取物用 LLP凈化 ,包括正己烷、飽和氯化鈉和二氯甲烷洗滌 ,然后用 C18固相萃取柱濃縮 /凈化 ,再用HPLCUV或 GCMS分析 ,除 OFZ外 ,回收率均在 65%以上 ,OFZ在肝臟和腎臟中的回收率僅為 45%和 39%。 ? Farrington等用乙酸乙酯提取肝組織中 5種苯并咪唑類殘留 ,并用酸性氧化鋁和 C18柱凈化 ,HPLCUV分離測(cè)定 ,回收率在 73%~90%。 ? Blanchflower等用甲醇 水 (20+7)提取肝和肌肉組織中FBZ和 OFZ,提取液用石油醚洗滌 ,經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋后 ,再用乙醚 乙酸乙酯 (60+40)洗滌 ,FBZ和 OFZ的回收率大于 80%和 70%。 ? Wilson等用乙酸乙酯提取肌肉和肝組織中 8種苯并咪唑類殘留。 ? Wilson方法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中苯并咪唑類殘留的提取 /凈化。 ? Hajee等對(duì)鰻魚(yú)肉的均質(zhì)液用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至 ,發(fā)現(xiàn)只有在 ~ ,所有的 MBZ標(biāo)志殘留物 (MBZ、MBZOH、 MBZNH2)呈中性 ,能被乙酸乙酯提取 。 ? 在 SPE凈化中分別采用正相和反相柱 ,發(fā)現(xiàn)氨基丙基柱較合適 。在過(guò)氨基丙基柱前 ,先用正己烷調(diào)節(jié)乙酸乙酯提取液的極性 ,上樣后 ,氨基丙基柱用異辛烷淋洗 ,再用甲醇洗脫 。MBZ、MBZNH2和 MBZOH的平均回收率分別為 80%、 60%和85%。 ? Cannavan等用乙酸乙酯提取肝、腎和肌肉組織均質(zhì)液 (調(diào)節(jié)至 )中 TBZ和 5OHTBZ,過(guò)氰丙基 (CN)SPE柱 ,TBZ和5OHTBZ的回收率分別為 96%~103%和 70%~85%,若采用氘化 TBZ作為內(nèi)標(biāo)物 ,可提高 5OHTBZ回收率的重現(xiàn)性。 ? Capece等在 、脂肪和腎臟組織中的 FBZ標(biāo)志殘留物 ,提取液直接 HPLC分析。 ? De Ruycke等在堿性條件下用乙酸乙酯提取雞蛋和肌肉組織中 FLU、 FLUHMET和 FLUHMET,提取液蒸干 ,再用甲醇和正己烷進(jìn)行液 液分配凈化 ,LCMS/MS分析 ,FLU標(biāo)志殘留物的回收率在 70%(雞蛋 )~87%(肌肉 )之間。 ? Edder等在堿性條件下從肝臟和肌肉中提取了 11種苯并咪唑類藥物和左旋咪唑殘留 ,用 MBC作為內(nèi)標(biāo) ,提取物經(jīng)甲醇和正己烷液 液分配凈化 ,回收率大于 70%。 ? 等等 (3)牛奶和奶制品 ? 奶制品相對(duì)
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