第六章基因的轉(zhuǎn)移技術(shù)(編輯修改稿)
2024-08-28 13:19 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 2) 兩棲動(dòng)物卵母細(xì)胞 第二節(jié) 外源基因的表達(dá) 一 . 當(dāng)外源基因引入某宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)，應(yīng)考慮以下各種因素： 1. 外源基因的啟動(dòng)子順序能否在宿主細(xì)胞起作用（利用表達(dá)載體） 2. 對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能否進(jìn)行加工修飾（利用 cDNA） 3. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性 4. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核糖體識(shí)別順序能否為宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)所識(shí)別（利用表達(dá)載體的基因融合技術(shù)） 5. 密碼子的使用頻率（選用適當(dāng)宿主細(xì)胞） 6. 翻譯產(chǎn)物的后修飾 選用適當(dāng)宿主細(xì)胞 7. 翻譯產(chǎn)物的穩(wěn)定性 8. 外源基因產(chǎn)物對(duì)宿主是否有害 9. 外源基因產(chǎn)物產(chǎn)量（選用不同拷貝數(shù)的載體） 10. 外源基因的最終產(chǎn)物是否具有生物活性（選用適當(dāng)宿主細(xì)胞） 11. 外源基因的穩(wěn)定性（改變宿主細(xì)胞遺傳特性，如將外源基因插入染色體） 12. 對(duì)于制備大量外源基因產(chǎn)物，還須考慮到表達(dá)產(chǎn)物與其它細(xì)胞成分的分離方法 二 . 表達(dá)系統(tǒng) 1. 大腸桿菌系統(tǒng) : 融合表達(dá)和直接表達(dá) 小于 80AAs的多肽可用融合表達(dá)系統(tǒng) , 分子量在 100300AAs 且無(wú)過(guò)多半胱氨酸的多肽可用直接表達(dá) pET(plasmid for expression by T7 RNA polymerase), pTrcHis系列載體 2. 酵母表達(dá)系統(tǒng) : 釀酒酵母 和 巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)系統(tǒng) 直接表達(dá)和分泌表達(dá) 3. 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 直接表達(dá)和分泌表達(dá) 4. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá) : 非微生物來(lái)源的大于 500AAs的分泌蛋白質(zhì)和表面受體蛋白 第八章 基 因 突 變 第一節(jié) 基因的體外定向突變 一 .缺失突變 1. 限制酶片段缺失 A:11233R E 1R E 1R E 1R E 1(1)(2) T4DN A連接酶B:1123R E 1R E 1(1)(3)(2)T4DN A連接酶44Bal 31C:111222333R E 1R E 1R E 1 R E 1R E 1R E 2R E 2R E 2R E 1T4D NA連 接酶444555666隨機(jī)斷裂插入RE3人 工接頭再連接R E 212R E 156R E 3（1 ）RE 2+ RE3（2 ）分離片段123R E 1R E 2R E 1456R E 3I123R E 1R E 2R E 1456R E 3II12R E 1 R E 26R E 3IIR E 25R E 3I2. 限制酶位點(diǎn)缺失 單向缺失R E ++A ABBCCD DEt B r RE 3’5’外切酶 S1DAABCD或AABCDD或3 39。 5 39。 5 39。 3 39。R E 1T4D NA連 接酶E x
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