06第六章-免疫學(xué)技術(shù)(編輯修改稿)
2024-08-31 07:24 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 10 /mL ? 細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時，可按 1： 3～ 1： 10的比例傳代。每 3～ 5天傳代一次。 ? 細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用 8氮鳥嘌呤進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。 4 5 6 （ 2）飼養(yǎng)細(xì)胞： ? 組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易繁殖，加入其它活細(xì)胞后可促進(jìn)這些細(xì)胞的繁殖，所加入的這種細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。 ? 在制備 McAb的過程中，許多環(huán)節(jié) 需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。 ? 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞 如：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞 ，小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。 ? 飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為 2 10 或 10 細(xì)胞 /孔。 4 5 2．細(xì)胞融合的步驟 （ 1）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層 ： 一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。 與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用 BALB/C小鼠， 6～ 10周齡 ↓ 拉頸處死，浸泡在 75%酒精內(nèi)， 3～ 5min ↓ 用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜 ↓ 用無菌注射器注入 5～ 6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管） ↓ 反復(fù)沖洗，吸出沖洗液 ↓ 沖洗液放入 10ml離心管， 1200rpm，離心， 5～ 6min ↓ 用 20%小牛血清（ NCS）或胎牛血清（ FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1 10 /ml ↓ 加入 96孔板， 100μL/孔 ↓ 放入 37 ℃ CO2 孵箱培養(yǎng) 5 （ 2）制備免疫脾細(xì)胞 最后一次加強(qiáng)免疫 3天后小鼠拉頸處死 ↓ 無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次 ↓ 脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng) ↓ 離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗 2次 ↓ 計(jì)數(shù) ↓ 取 10 脾淋巴細(xì)胞懸液備用 8 （ 3）制備骨髓瘤細(xì)胞 取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心 ↓ 用無血清培養(yǎng)液洗 2次 ↓ 計(jì)數(shù)，取得 10 細(xì)胞備用 7 （ 4）融合 ①、將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按 1： 10或 1： 5混合，在 50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗 1次，離心， 1200rpm,8min。棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響 聚乙二醇 （ PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動。 ②、 90s內(nèi)加入 37℃ 預(yù)溫的 1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。 37℃ 水浴作用90s。 ③、加 37 ℃ 預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止 PEG作用，每隔 2min分別加入 1ml、 2ml、 3ml、 4ml、 5ml和6ml。 ④ 、離心， 800rpm, 6min。 ⑤、棄上清，用含 20%小牛血清 HAT選擇培養(yǎng)液重懸。 ⑥、將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的 96孔板內(nèi)，每孔加 100μl。一般一個免疫脾臟可接種 4塊 96孔板。 ⑦、將培養(yǎng)板置 37℃ 、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測 1． HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 ? 脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng) PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。 ? 在 HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。 ? ? 用 HAT選擇培養(yǎng) 3～ 4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落。 ? HAT選擇培養(yǎng)液維持 7～ 10天后應(yīng)換用 HT培養(yǎng)液，再維持 2周，改用一般培養(yǎng)液。 ? 在選擇培養(yǎng)期間，一般每 2～ 3天換一半培養(yǎng)液。 ? 選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底 1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。 2．抗體的檢測 ? （ 1）放射免疫測定（ RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞 McAb的檢測。 ? （ 2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和 病毒 等 McAb的檢測。 ? （ 3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測。 ? （ 4）其它：如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。 （四）雜交瘤的克隆化 ? 雜交瘤克隆化：將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。 ? 因?yàn)榻?jīng)過 HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實(shí)際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。 ? 克隆化的原則： 對于檢測抗體陽性的雜交克隆 盡早進(jìn)行 克隆化， 否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制 。 ? 因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度
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