第六章基因的轉(zhuǎn)移技術(shù)(更新版)
【正文】 兩末端不同結(jié)構(gòu) : (1) 539。 ii. 小細(xì)胞系統(tǒng) (minicell system) 突變株（ min A， min B）可形成大量無核小細(xì)胞，但細(xì)胞中的質(zhì)粒 DNA可進(jìn)入小細(xì)胞，當(dāng)純化的小細(xì)胞與帶標(biāo)記的氨基酸共培養(yǎng)，質(zhì)粒上攜帶的外源基因便可獲得表達(dá)，產(chǎn)物用SDS— PAGE檢查。 3. 其它系統(tǒng)： 鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和釀酒酵母裂解物等 。 12． 接合轉(zhuǎn)移法 適用于細(xì)菌之間和細(xì)菌與植物細(xì)胞之間，這種 DNA轉(zhuǎn)移是借助于某些質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移基因產(chǎn)物 13．超聲波法 現(xiàn)已用于植物細(xì)胞，可能還可用于其它生物 14. 基因槍法 二．轉(zhuǎn)移方法的選擇 選擇方法的依據(jù)： 1．轉(zhuǎn)化頻率 取決于以下幾個因素： 1) 外源 DNA能否易于進(jìn)入宿主細(xì)胞； 2) 重組 DNA分子能否自主復(fù)制 3) 標(biāo)記基因表達(dá)效率 ： 是否具有選擇壓力 ： 細(xì)胞大小，有無細(xì)胞壁，除去細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體能否易于再生 ： 儀器，載體種類等 第二節(jié) 轉(zhuǎn)化體的檢測 1. 藥物抗性檢測 如用于細(xì)菌 , 真菌 , 植物和動物細(xì)胞的各種抗生素抗性基因 : Ampr, Kanr, Hygr, G418r, Tcr等 2. 遺傳互補(bǔ)檢測 如用于酵母菌的各種氨基酸 , 核苷酸合成酶基因 : LEU2, TRP1, TRP3, URA3等 3. 表型選擇 如用于細(xì)菌 , 植物和動物的 LacZ, GUS等基因 。調(diào)控亦是在起始階段 4） 翻譯后修飾 ：蛋白質(zhì)的糖基化，蛋白質(zhì)水解反應(yīng)，蛋白質(zhì)的分泌等。由于該核酸酶的活性依賴于 Ca2+，當(dāng)除去內(nèi)源 mRNA后，可用 EGTA除去 Ca2+，此系統(tǒng)仍可保持 70%的活性。 2) 體外基因表達(dá)系 ，加入外源 DNA和必須因子后可得表達(dá)產(chǎn)物。(2)第一種限制酶切 , 脫磷酸化或 α磷酸硫代物 dNTP補(bǔ)齊末端 ,第二種限制酶切 ,然后 λ外切酶或 ExoIII作用 . 3. 低聚核苷酸定向缺失 R E 1R E 1R E 2 R E 2R E 2R E 2339。 E x o I I I S 1AA ABB BCC CA39。退火 Po l IdN T P轉(zhuǎn)化大腸桿菌ABCA39。C39。低聚核苷酸插入 二 . 插入突變 在已知的位點處插入一段 DNA,其方法與缺失突變體十分相似 ,只是反其道行之 三 . 點突變 1. 區(qū)域隨機(jī)突變 RE RE誘變RE RERE RE(1 ) RE 酶切(2 ) 分離片段誘變 與大片段 連 接+EtBr或 DNase I外切酶核苷酸類似物P ol I亞硝酸羥胺甲氧胺N aH SO 3C T2. 低聚核苷酸定向突變 退火 P o l Id N T P轉(zhuǎn)化大腸桿菌I IIA:+T 4 D NAL ig a seB:轉(zhuǎn)化大腸桿菌R E T4 DN A Po lREP o l I KT 4 D N A l i g a s eI IIC:3. 人工接頭掃描法 1)利用 ExoIII/S1從 DNA兩端進(jìn)行順序缺失 ,獲一系列 5
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