第六章基因的轉(zhuǎn)移技術(shù)-展示頁
2024-08-16 13:19本頁面
【正文】 1(1)(2) T4DN A連接酶B:1123R E 1R E 1(1)(3)(2)T4DN A連接酶44Bal 31C:111222333R E 1R E 1R E 1 R E 1R E 1R E 2R E 2R E 2R E 1T4D NA連 接酶444555666隨機(jī)斷裂插入RE3人 工接頭再連接R E 212R E 156R E 3（1 ）RE 2+ RE3（2 ）分離片段123R E 1R E 2R E 1456R E 3I123R E 1R E 2R E 1456R E 3II12R E 1 R E 26R E 3IIR E 25R E 3I2. 限制酶位點(diǎn)缺失 單向缺失R E ++A ABBCCD DEt B r RE 3’5’外切酶 S1DAABCD或AABCDD或3 39。加入標(biāo)記氨基酸后，質(zhì)粒上的外源基因可獲帶標(biāo)記產(chǎn)物，用SDS— PAGE分析。 ii. 小細(xì)胞系統(tǒng) (minicell system) 突變株（ min A， min B）可形成大量無核小細(xì)胞，但細(xì)胞中的質(zhì)粒 DNA可進(jìn)入小細(xì)胞，當(dāng)純化的小細(xì)胞與帶標(biāo)記的氨基酸共培養(yǎng)，質(zhì)粒上攜帶的外源基因便可獲得表達(dá)，產(chǎn)物用SDS— PAGE檢查。新合成的蛋白質(zhì)用 SDS— PAGE檢查。 因該系統(tǒng)無內(nèi)源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子 mRNA 的翻譯。 微球菌核酸酶可除去內(nèi)源 mRNA，同時(shí)也不會(huì)對(duì)系統(tǒng)中的 tRNA和 rRNA 損傷過大。 3. 其它系統(tǒng)： 鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和釀酒酵母裂解物等 。 2. 小麥胚抽提物 (wheat germ extract) 該系統(tǒng)不具內(nèi)源 mRNA，屬外源 mRNA 依賴型，利用SephadexG50可減少該系統(tǒng)中的內(nèi)源氨基酸，因而可大大增加翻譯產(chǎn)物的高比活性。 一．轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 1. 體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 1）分離 RNA聚合酶，然后在體外進(jìn)行待測(cè) DNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 2）利用全細(xì)胞抽提液，加入外源 DNA，目前使用最廣泛的抽提液來自海拉細(xì)胞和 KB細(xì)胞 3）利用具有 SP6, T3和 T7啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)錄插入的外源 DNA 2. 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 先分離細(xì)胞核，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 二．翻譯系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng) （ In vitro translation system）又稱之為體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) (in vitro protein synthesis system)，是一種細(xì)胞裂解物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當(dāng)加入外源 mRNA，能量物質(zhì)和氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng) SDS— PAGE后可檢測(cè)出翻譯活性。基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控主要是起始階段 2） 轉(zhuǎn)錄后修飾 ： hnRNA 的加帽，加尾，拼接 3） 翻譯 ：起始，延長和終止。 12． 接合轉(zhuǎn)移法 適用于細(xì)菌之間和細(xì)菌與植物細(xì)胞之間，這種 DNA轉(zhuǎn)移是借助于某些質(zhì)粒上的轉(zhuǎn)移基因產(chǎn)物 13．超聲波法 現(xiàn)已用于植物細(xì)胞，可能還可用于其它生物 14. 基因槍法 二．轉(zhuǎn)移方法的選擇 選擇方法的依據(jù)： 1．轉(zhuǎn)化頻率 取決于以下幾個(gè)因素： 1) 外源 DNA能否易于
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