原核表達載體(編輯修改稿)
2025-09-01 03:30 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 pm離心1 min。⑧重復(fù)步驟⑦一次。⑨取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫12000 rpm離心1 min。⑩ mL滅菌離心管中，在柱膜中央加入60 μl 75℃預(yù)熱的ddH2O，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。離心管中的液體即為質(zhì)粒?？闪⒓词褂没虮４嬗?0℃?zhèn)溆?。? 重組質(zhì)粒的酶切鑒定酶切反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間根據(jù)內(nèi)切酶的種類確定設(shè)計。%瓊脂糖凝膠分離。 Ⅷ. 重組質(zhì)粒的目的基因的序列測定重組質(zhì)粒由測序公司測序。 Ⅸ. 菌種保存取500μl重組菌液加入等體積50%的無菌甘油(終濃度達到25%)，液氮速凍，80℃保存。（3）目的基因的原核表達Ⅰ. 原核表達載體的構(gòu)建 ①克隆載體的構(gòu)建：必須考慮使用的克隆載體有無多克隆位點，沒有就要特別設(shè)計一對上下游引物，分別帶上酶切位點，以便插入原核表達載體上相應(yīng)的多克隆位點。構(gòu)建克隆載體的方法參見上面步驟。②重組質(zhì)粒和表達載體的酶切：酶切反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間根據(jù)內(nèi)切酶的種類確定設(shè)計。%瓊脂糖凝膠分離。 ③回收表達載體酶切片斷和目的基因酶切片斷： i. 在紫外燈下迅速用干凈的手術(shù)刀切下含目的基因的瓊脂糖凝膠塊，放入已稱重的離心管中，在保證目的基因全部回收的同時，應(yīng)盡量減少膠的體積。ii. 計算凝膠重量（100 mg相當(dāng)于100 μl），加入3倍體積solution DEA，75℃水浴68分鐘，其間輕柔地顛倒離心管至膠完全融化。iii. 加入2倍體積solution DEB，顛倒混勻，將溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置1 min，12000 rpm離心1 min。iv. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，加入600 μl Wash solution，室溫12000 rpm離心30 s。v. 重復(fù)步驟④一次。vi. 取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，室溫12000 rpm離心1 min。vii. mL滅菌離心管中，在柱膜中央加入30 μl 75℃預(yù)熱的ddH2O，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。離心管中的液體即為回收的目的基因片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆谩? ④表達載體酶切大片斷和目的基因的連接（根據(jù)連接酶說明書方法操作） 連接反應(yīng)體系 反應(yīng)液成分 體積10T4 Buffer μl ddH2O
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