綠色熒光蛋白(gfp)原核表達(dá)分析報(bào)告(編輯修改稿)
2025-08-29 21:45 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 位置加入適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液EB 30μl，洗脫緩沖液先在65℃水浴預(yù)熱，冷卻至室溫，12000rpm離心1min，然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，12000rpm離心1min；（9）電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物，余置于20℃下保存。透射儀觀察結(jié)果，并拍照。 把PCR擴(kuò)增的目的基因片段產(chǎn)物與pGMT載體連接，反應(yīng)體系如下：體系成分體積(μL)ddH2O10T4 DNA目的片段（回收）pGMT載體T4 DNA ligaseTotal大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2法。（1） DH5α菌株甘油管用無(wú)菌去離子水1:100稀釋后，平板劃線法接種在無(wú)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，見(jiàn)有菌落長(zhǎng)出，用接種環(huán)從平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到20ml無(wú)抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜， DH5α菌株；（2）按照1%接種量，從上述培養(yǎng)液中吸取菌液2ml，轉(zhuǎn)瓶接入200ml新鮮的無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,；（3）在已滅菌的10ml離心管中吸取上述培養(yǎng)液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm離心2min，收集菌體，棄上清；（4），重懸菌體，冰浴10min，4℃、6000rpm離心2min，收集菌體，棄上清；（5）～1ml含有20%，輕輕重懸菌體沉淀，冰上放置10分鐘；（6）分裝100μL/管（冰浴分裝），置于70℃冰箱中保存。(1)轉(zhuǎn)化用固體LB培養(yǎng)基平板制備：向含100μg/ml氨芐青霉素（AMP）的固體LB培養(yǎng)基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的Xgal 40μL，用滅菌彎頭玻璃棒涂布均勻，37℃避光倒置3h，讓溶解Xgal的二甲基甲酰胺盡量揮發(fā)干凈。加入ITPG和Xgal的轉(zhuǎn)化用平板應(yīng)避光保存，以防試劑見(jiàn)光分解。（2） DH5α感受態(tài)細(xì)胞：①取5μl連接產(chǎn)物加到100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。輕彈混勻，水浴20min。②取出離心管，42 ℃水浴中熱激90 后，立即置冰浴中冷卻5min。③向離心管中加入800μL 37℃預(yù)熱的無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基。④取出離心管，12000rpm離心2min，棄上清800μL，用剩余的約100μL上清將沉淀菌體吸打混勻后，在LB平板上涂布ITPG和Xgal。將平板倒置在37℃恒溫箱中培養(yǎng)14h～18h，直至長(zhǎng)出菌落，觀察結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)所用的pGMT vector 含Ampr、lacZ基因，所以有重組質(zhì)粒的菌落為白色，沒(méi)有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。具體操作如下：①挑取菌落：使用無(wú)菌槍頭隨即挑取5個(gè)白色菌落， EP管，振蕩培養(yǎng)4h以上，其余繼續(xù)培養(yǎng)。②PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序均與目的基因擴(kuò)增條件一致。③擴(kuò)增產(chǎn)物取5ul用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。 將鑒定為陽(yáng)性重組子的質(zhì)粒EP管挑取出來(lái)，按照實(shí)驗(yàn)室提取質(zhì)粒的試劑盒說(shuō)明書操作。提取后，取5ul用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。用限制性內(nèi)切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ對(duì)PCR陽(yáng)性菌落提取的質(zhì)粒做雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系如下表。體系成分體積質(zhì)粒去離子水11ul10Buffer TBamHⅠ（120U/ul）SalⅠ(100
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