【文章內(nèi)容簡介】 藥品 （ 一 ） 制種設備 1． 配制培養(yǎng)基設備：切片機 、 粉碎機 、 過篩機 、 拌料機 、 裝瓶或裝袋機 2． 滅菌設備：高壓滅菌鍋 （ 手提式 、 立式 、臥式 ） 、 常壓滅菌灶 3． 接種設備：凈化工作臺 、 接種箱 、 接種室 4． 培養(yǎng)設備：培養(yǎng)箱 （ 電熱恒溫 、 恒溫恒濕 ） 、 培養(yǎng)室 、 培養(yǎng)架 、 空調(diào) 5． 菌種保藏設備：電冰箱 菌種生產(chǎn)類型及生產(chǎn)流程 — 制種設備、器材、藥品 （ 二 ） 基本器具 玻璃器皿：試管 、 三角瓶 、 培養(yǎng)皿 、 漏斗 、 燒杯 、 酒精燈 、 菌種瓶 、 試劑瓶等 衡量器具：天平 、 桿秤 、 磅秤 、 量杯 、量筒 、 移液管等 基礎設備：藥品櫥、玻璃器皿櫥、一級種配料工作臺 …… 菌種生產(chǎn)類型及生產(chǎn)流程 — 制種設備、器材、藥品 （ 三 ） 基本藥品 一級菌種常用化學藥劑：化學純的葡萄糖 、 蔗糖 、 蛋白胨 、 KH2PO K2HPO MgSONaOH、 HCl、 麥芽浸出膏 、 酵母浸出膏 、 廣泛或精密 pH試紙等 。 二、三級菌種常用化學藥品：工業(yè)級的石膏、碳酸鈣、石灰、 MgSO過磷酸鈣、KH2PO K2HPO4等。 菌種生產(chǎn)類型及生產(chǎn)流程 — 復習思考題 1． 什么叫培養(yǎng)基 ？ 培養(yǎng)基可分為哪幾種類型 ？ 2． 什么叫菌種 ？ 菌種可分為哪幾種類型 ？ 3． 菌種為什么要經(jīng)過三級逐步擴大培養(yǎng) ？ 4．簡述菌種生產(chǎn)的基本過程？ 返回 一級菌種制作技術 — 概述 一 、 概述 1． 概念 一級菌種是第一次用孢子分離法 、 組織分離法或基內(nèi)菌絲分離法獲得的純菌絲體及其經(jīng)過轉管擴大后的菌絲體 。 2． 用途及要求 一級菌種是菌種生產(chǎn)的基礎 ， 一級菌種質(zhì)量的優(yōu)劣 ，直接關系到二級菌種和三級菌種的質(zhì)量 ， 對食用菌生產(chǎn)產(chǎn)生根本的影響 。 制種過程 一級菌種的制作過程 ， 主要包括下列幾個程序： 培養(yǎng)基的配制 ?培養(yǎng)基的滅菌 ?菌種的分離 ?純化（提純） ?轉管擴大 ?培養(yǎng) ?一級菌種 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的配制 （ 一 ） 基本要求 營養(yǎng)成分：必須營養(yǎng)全面且易于吸收。 容器：一級菌種培養(yǎng)基通常用玻璃試管作容器 ， 按不同的配方加上瓊脂凝固劑 ， 制成瓊脂斜面培養(yǎng)基 ， 又叫斜面培養(yǎng)基 ， 簡稱斜面 。 （ 二 ） 一級菌種培養(yǎng)基常用的材料 在配制一級菌種培養(yǎng)基時 ， 選用的原材料要具備以下二個條件：一是要能滿足食用菌的營養(yǎng)需要；二是所用原材料來源廣 ， 成本低 。 瓊脂 （ 又稱洋菜 ） 是一級菌種培養(yǎng)基常用的凝固劑 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的配制 （ 三 ） 一級菌種培養(yǎng)基常用的配方 1． 常用配方 PDA培養(yǎng)基 PSA培養(yǎng)基 馬鈴薯 （ 去皮 ） 200g 馬鈴薯 （ 去皮 ） 200g 葡萄糖 20g 蔗糖 20g 瓊脂 18～ 23g 瓊脂 18～ 23g 水 1000ml 水 1000ml 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的配制 （ 三 ） 一級菌種培養(yǎng)基常用的配方 2． 一級菌種培養(yǎng)基配方設計 組成一級種培養(yǎng)基的材料大致可分為四種： ① 天然的有機物：應選擇新鮮 、 無霉味 、 無蟲蛀 、 無變質(zhì)的優(yōu)質(zhì)材料 ， 經(jīng)熱浸提后取濾液入料 ， 為食用菌生長提供全面的營養(yǎng) 。 ② 可溶性的有機營養(yǎng)制劑：主要是為食用菌生長提供優(yōu)質(zhì)的碳源和氮源 ， 要求純度高 ， 保藏良好 。 ③ 礦物質(zhì)：多在改良培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基中作為食用菌對礦物質(zhì)需求的補充劑 ， 同時對培養(yǎng)基物理性狀的改良起重要作用 。 其用量為 %～ %。 ④ 瓊脂：是固化培養(yǎng)基最常用的凝固劑，一般用量為 2%。 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的配制 （ 四 ） 一級菌種培養(yǎng)基的配制 一級菌種培養(yǎng)基配方較多 ， 原料較多 ， 但制作方法大致相同 。 平板培養(yǎng)基的制作 平板培養(yǎng)基常用于單孢分離 ， 測定菌絲生長速度 ， 觀察菌落的形態(tài) ， 拮抗實驗 ， 測定接種空間雜菌數(shù) 。 制作方法 ： ① 將培養(yǎng)皿洗凈 、 干燥 ， 使各培養(yǎng)皿蓋方向一致 ， 用牛皮紙包好 ， 或放入特制鐵罐內(nèi) ， 注明皿蓋的方向 。 高壓滅菌或干燥滅菌后備用 。 ② 取剛滅菌后尚未凝固的培養(yǎng)基置于無菌箱或超凈工作臺內(nèi) ，略打開滅菌過的培養(yǎng)皿蓋 （ 露一小縫 ） ， 倒入培養(yǎng)基 （ 厚度為） ， 封蓋 、 冷凝 ， 倒置備用 。 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的滅菌 （ 一 ） 消毒與滅菌的概念 滅菌： 是應用物理和化學方法殺滅物品表面和內(nèi)部所有的微生物 ， 是一種徹底的滅菌方法 。 消毒 ： 是應用物理和化學方法使欲消毒的物品表面和孔隙內(nèi)絕大部分微生物致死 ， 是一種不徹底的滅菌方法 。 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的滅菌 （ 二 ） 消毒與滅菌的方法 常用的滅菌方法 火焰滅菌 用于金屬器具 ， 火焰灼燒至紅 （ 在火焰 2/3處燒 ） 干燥箱滅菌 用于玻璃器皿 （ 培養(yǎng)皿 、 試管 、 三角瓶 、 吸管 ） 等 。 洗凈 ?晾干 ?包裝 ?放入干燥箱 ?升溫 ?160～170℃ ， 保持 1～ 2h ?關閉電源 ， 自然降溫 ?60℃ 以下打開干燥箱 ?取出滅菌物品 ， 盡快使用 。 干熱滅菌 濕熱滅菌 常壓滅菌 間歇滅菌 第一次蒸 ， 100℃ 保持 1 h ?2837℃ 下培養(yǎng) 24 h ?第二次蒸 ， 100℃ ， 保持 1 h ?培養(yǎng) 24 h ?第三次蒸 ， 100℃ ， 保持 1 h。 不常用的原因：滅菌一鍋需要 3～ 4天時間 ， 且冬天需要保溫 。 持續(xù)滅菌 蒸 ， 100℃ 保持 12～ 14 h（ 方法：攻頭 ， 控中間 ， 保尾 ） 。 普遍采用 ， 特別用于大規(guī)模塑料袋制種和塑料栽培筒的滅菌 。 注意：常壓滅菌鍋要設計合理 ， 主要是滅菌徹底與否 、 燃料費用 、 周轉速度 、 勞動強度、 污染率的高低 ， 直接影響經(jīng)濟效益 。 高壓滅菌 手 提式高壓滅菌鍋：用于一級菌種培養(yǎng)基滅菌 。 臥式或立式高壓滅菌鍋：用于二 、 三級菌種培養(yǎng)基滅菌 。 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的滅菌 （ 二 ） 消毒與滅菌的方法 常用的消毒方法 空間消毒 藥液噴霧 藥劑薰蒸 紫外線照射 %的新潔爾滅 ， 5%的石碳酸 ， %的多菌靈等 。 用量不小于 30ml/m3；霧粒越細越好；適時更換藥液 （ 防止抗藥性 ） 。 10～ 20ml的甲醛 +5～ 8g的高錳酸鉀 / m3；氣霧消毒盒 ， 2～ 6g/ m3； 照 30min后 ， 再過 30min開照明燈 器具消毒 藥液浸泡 煮沸消毒 75%的酒精；藥物揩擦 煮沸 20min以上 培養(yǎng)料消毒 熟石灰拌料；殺菌劑拌料 （ %~%的多菌靈 ） ；巴氏消毒 （ 發(fā)酵 ） 分離材料消毒 75%的酒精棉球擦拭； %升汞浸泡 ~1min?無菌水沖洗 3次 ?無菌紙吸干 一級菌種制作技術 — 一級菌種培養(yǎng)基的滅菌 （ 三 ） 一級菌種培養(yǎng)基的滅菌 1． 滅菌設備：手提式高壓滅菌鍋 2． 具體滅菌要求： ， 121℃ ， 保持 20~30min。 3． 操作過程 加水 ?裝鍋 ?蓋蓋 ?加熱 ?當壓力升為 時排放冷空氣 ?正式升壓 ?保壓（ ， 121℃ ，保持 2030min） ?停止加熱 ?自然降壓至零 ?排放余汽?開蓋 ?取出滅菌物品 ?趁熱擺斜面 ?檢驗滅菌效果（ 32℃ 空白培養(yǎng) 48h）。 一級菌種制作技術 — 菌種分離 （ 一 ） 菌種分離的概念 菌種分離：用無菌操作的方法將所需要的食用菌從混雜的微生物群體中單獨分離出來的過程 。 通過菌種分離得到的純菌絲體即為一級菌種 。 （ 二 ） 菌種分離的關鍵 嚴格按無菌操作規(guī)程進行 無菌操作：任何一個操作過程都要注意避免把其它任何無關的菌體帶入到培養(yǎng)基中 。 注意二點： 1． 嚴格樹立無菌觀念； 2． 嚴格遵循無菌操作規(guī)程 。 一級菌種制作技術 — 菌種分離 （ 三 ） 菌種分離的設備 1． 接種箱：操作規(guī)程 2． 凈化工作臺：操作規(guī)程 3． 接種室：操作規(guī)程 （ 四 ） 菌種分離的方法 食用菌的分離方法很多 ， 常用的有組織分離法 、 孢子分離法和基內(nèi)菌絲分離法三種 。 一級菌種制作技術 — 菌種分離 （四）菌種分離的方法 1． 組織分離法 （ 1） 概念 將食用菌的部分組織移接到斜面培養(yǎng)基上獲得純培養(yǎng)的方法 。 （ 2） 特點： ① 屬于無性繁殖 ， 能保持原有菌株的優(yōu)良種性 ， 是獲得純菌種的常用方法 ， 且簡單易行 。 ② 適用于大型肉質(zhì)子實體 ， 適用于孢子不易萌發(fā)的菌類 。 ③ 若種菇感染病毒 ， 不易脫毒 。 （ 3） 操作過程 （ 以傘菌類為例 ） 種菇選擇 — 種菇消毒 — 切取組織塊 — 移接組織塊至斜面中央 — 培養(yǎng) （ 25℃ 左右 ） 一級菌種制作技術 — 菌種分離 （四）菌種分離的方法 2． 孢子分離法 （ 1） 概念 利用子實體產(chǎn)生的成熟有性孢子分離培養(yǎng)獲得純菌種的方法 。 （ 2） 特點 ① 屬于有性繁殖 ， 后代易發(fā)生變異 ， 可用此法培育新品種 。 ② 分離過程較復雜 ， 適用于膠質(zhì)菌類和小型傘菌 。 （ 3） 操作過程 孢子的采集 孢子的分離 孢子的萌發(fā) 一級菌種制作技術 — 菌種分離 （四）菌種分離的方法 3． 基內(nèi)菌絲分離法 (基質(zhì)分離法 ) 概念：從生長子實體的培養(yǎng)基中分離菌絲獲得純培養(yǎng)的方法 。 特點：易感染雜菌 。 基內(nèi)菌絲分離法一般只在下列情況下采用： ① 子實體已腐爛 ， 但又必須保留該種菌種 。 ② 有些子實體小而薄 ， 用組織分離法和孢子分離法較困難 。 ③ 還有一些菌類如銀耳菌絲，只有與香灰菌絲生長在一起才能產(chǎn)生子實體，如果要同時得到這兩種菌絲的混合種，也只能采用基內(nèi)菌絲分離法進行分離。 一級菌種制作技術 — 菌種的純化 一級菌種的純化：是指對分離獲得的菌種進行再提純 ， 成為生產(chǎn)所需要的菌種的方法 。 1． 菌絲的再提純 再提純時，可選用菌落生長速度較為一致的菌絲體作為再提純對象，用消毒的接種鏟切取菌絲的前端部分（連同培養(yǎng)基一起），轉移到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。如果菌絲生長稀疏，也可采用單根菌絲分離法。經(jīng)過幾次的切割移植，逐漸挑選生長良好的無雜菌菌株，從而獲得純菌種。 一級菌種制作技術 — 菌種的純化 2． 污染物的排除 在菌種分離后 ， 細菌 、 霉菌的污染時有發(fā)生 ， 必須加以排除 。 一般來講 ， 被雜菌污染的菌株不再使用 。 但有時由于菌種緊缺 ， 并且污染物不多 ， 也可用滅菌濾紙浸在 1％ 的多菌靈溶液中 ， 然后取出覆蓋于霉菌的生長點上 ， 以防止分生孢子的擴散 ， 然后用接種鏟切取一小塊遠離雜菌的健壯菌絲移至新的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng) 。 如果是細菌污染 ， 細菌的菌落比較局限 ， 并不會出現(xiàn)細胞飛揚現(xiàn)象 ， 因此 ， 可以先用接種鏟將細菌菌落連同培養(yǎng)基一起取出來 ， 再從無菌部位取菌絲塊轉管一次 ， 同樣可以獲得純菌種 。 一級菌種制作技術 — 出菇鑒定（試驗） 概念： 是菌種投入生產(chǎn)前必須做的結實性鑒定試驗 。 目的： 進一步確定菌種 ， 以避免菌種選育不當而造成不可估量的損失 。 內(nèi)容： 包括生產(chǎn)性狀、商品性狀、遺傳性狀三個方面。 一級菌種制作技術 — 擴大培養(yǎng)（轉管） 一級菌種的擴大培養(yǎng)是在試管間進行的 ， 因此又叫轉管 。 轉管原因： 從外地購進或分離獲得的母種數(shù)量有限 ， 不能滿足生產(chǎn)的需要時 ， 要對初次獲得的母種進行擴大繁殖 ， 以增加母種數(shù)量 。 轉管數(shù)量： 一支母種可接 15～ 20支試管斜面 ， 擴大的數(shù)量根據(jù)實際情況而定 。