關(guān)于研究蛋白質(zhì)細(xì)胞定位的幾種方法(編輯修改稿)
2025-08-28 12:35 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 GFP分子中形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團(tuán)，該過程可自動(dòng)催化合成(Heim R,Douglas CP.,1994) GFP晶體結(jié)構(gòu) (如圖 )顯示： 蛋白中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長(zhǎng) 420nm,寬 240nm，由 11個(gè)圍繞中心 a螺旋的反平行 β 折疊組成，熒光基團(tuán)的形成是從這個(gè)螺旋開始，桶的頂部由 3個(gè)短的垂直片段覆蓋，底部由 1個(gè)短的垂直片段覆蓋，生色團(tuán)位于大空腔內(nèi) (CubittAB, 1999)。 GFP在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用 GFP雖能自發(fā)熒光，但野生型 GFP熒光較弱。為了改善 GFP熒光特性，對(duì) GFP進(jìn)行了突變和重組實(shí)驗(yàn)。 Pang等獲得的 GFP突變型比野生型亮度增強(qiáng) 20倍 。Tian等發(fā)現(xiàn)野生型 GFP是低水平表達(dá)，而改良后的 GFP表達(dá)量增加 100倍。 Cormack等獲得的三位點(diǎn)替代突變體的熒光強(qiáng)度比野生型高 100倍，而且在自然光下就能觀察到綠色熒光，使得 gfp作為報(bào)告基因更為靈敏和迅速。 Confocal能有效消除同一焦平面上非檢測(cè)點(diǎn)的雜散熒光和非焦平面熒光的干擾，使分辨率提高，獲得清晰圖象，而且它具有逐層掃描功能，可對(duì)組織細(xì)胞進(jìn)行無損傷的系列光學(xué)切片。Confocal的應(yīng)用更有利于 GFP在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。 原理 應(yīng)用 DNA亞克隆技術(shù)，將目的基因與 GFP基因構(gòu)成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，利用目的基因的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，如啟動(dòng)子和信號(hào)序列來控制融合基因的表達(dá)，在熒光顯微觀察系統(tǒng)下監(jiān)測(cè)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)。 目的基因 融 合基因 gfp 轉(zhuǎn)化 表達(dá) 熒光顯微觀察 細(xì)胞器研究 在植物發(fā)育過程中可以利用 GFP直接觀察生活細(xì)胞中線粒體的數(shù)目、分配和運(yùn)動(dòng)。將 GFP與某一導(dǎo)肽序列融合可將 GFP定位到特定的細(xì)胞器和
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