關(guān)于研究蛋白質(zhì)細胞定位的幾種方法(編輯修改稿)
2025-08-28 12:35 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團，該過程可自動催化合成(Heim R,Douglas CP.,1994) GFP晶體結(jié)構(gòu) (如圖 )顯示： 蛋白中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長 420nm,寬 240nm，由 11個圍繞中心 a螺旋的反平行 β 折疊組成，熒光基團的形成是從這個螺旋開始，桶的頂部由 3個短的垂直片段覆蓋，底部由 1個短的垂直片段覆蓋，生色團位于大空腔內(nèi) (CubittAB, 1999)。 GFP在生命科學研究中的應(yīng)用 GFP雖能自發(fā)熒光，但野生型 GFP熒光較弱。為了改善 GFP熒光特性，對 GFP進行了突變和重組實驗。 Pang等獲得的 GFP突變型比野生型亮度增強 20倍 。Tian等發(fā)現(xiàn)野生型 GFP是低水平表達，而改良后的 GFP表達量增加 100倍。 Cormack等獲得的三位點替代突變體的熒光強度比野生型高 100倍，而且在自然光下就能觀察到綠色熒光，使得 gfp作為報告基因更為靈敏和迅速。 Confocal能有效消除同一焦平面上非檢測點的雜散熒光和非焦平面熒光的干擾，使分辨率提高，獲得清晰圖象，而且它具有逐層掃描功能，可對組織細胞進行無損傷的系列光學切片。Confocal的應(yīng)用更有利于 GFP在生物學研究中的應(yīng)用。 原理 應(yīng)用 DNA亞克隆技術(shù)，將目的基因與 GFP基因構(gòu)成融合基因，通過愈傷組織轉(zhuǎn)化法、基因槍、顯微注射、電激轉(zhuǎn)化等方法轉(zhuǎn)化合適的細胞，利用目的基因的基因表達調(diào)控機制，如啟動子和信號序列來控制融合基因的表達，在熒光顯微觀察系統(tǒng)下監(jiān)測融合蛋白在細胞內(nèi)的存在狀態(tài)。 目的基因 融 合基因 gfp 轉(zhuǎn)化 表達 熒光顯微觀察 細胞器研究 在植物發(fā)育過程中可以利用 GFP直接觀察生活細胞中線粒體的數(shù)目、分配和運動。將 GFP與某一導肽序列融合可將 GFP定位到特定的細胞器和
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