【文章內容簡介】 2 % DEPC的蒸餾水中過夜處理，然后高壓蒸汽滅菌； mL DEPC，搖勻后高壓蒸汽滅菌，備用。XGal（20 mg/ml）：稱取 100 mg XGal置于50 ml容量瓶中，加入二甲基甲酰胺( N,Ndimethylformmide)定容至50 ml，充分溶解混勻后， 181。M 無菌濾膜過濾滅菌，分裝后于20℃ 保存?zhèn)溆?。IPTG (20 mg/ml)：稱取 100 mg IPTG 置于5 ml容量瓶中，加入蒸餾水定容至5 ml， 181。M無菌濾膜過濾滅菌，分裝后于20℃ 保存?zhèn)溆谩０逼S青霉素（Ampcillin）（100 mg/ml）：稱取 1 g Ampcillin 于10 ml容量瓶中，加入去離子水定容至10 ml，待充分溶解混勻后， 181。m 無菌膜過濾滅菌，分裝后于20℃ 保存?zhèn)溆?。蛋白?K（600 mg / ml）：稱取 30 mg 蛋白酶 K置于50 ml容量瓶中，加入去離子水定容至50 ml； 181。M 無菌濾膜過濾，于20℃保存?zhèn)溆?。LB / Ampicillin液體培養(yǎng)基(1 L)：按質量體積比1:1000的比例將Ampicillin(100 mg / mL)加入已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，常溫備用。LB / Ampicillin / IPTG / XGal平板：將高壓蒸汽滅菌后的LB培養(yǎng)基常溫冷卻至60℃左右時(超過60℃Ampicillin會失效)，% IPTG (20 mg/ml)、% Ampicillin（100 mg / ml）% XGal（20 mg/ml）加入到LB培養(yǎng)基中，溶解混勻后倒平板于滅菌的培養(yǎng)皿中，4℃倒置避光保存?zhèn)溆谩?0TAE電泳緩沖液（pH ）：100 ml g Na2EDTA2H2O ， g Tris ml 冰醋酸，充分溶解混勻后滅菌備用。 方法 馬鈴薯腐爛莖線蟲總RNA的提取線蟲總RNA的提取采用TRIzol法，步驟如下：（1）將皿蓋上分離下的馬鈴薯腐爛莖線蟲用滅菌水洗滌3次， ml Eppendorf離心管中，立即加入1 ml TRIzol溶液，反復搖勻；（2）將離心管在液氮和37℃水浴中交替放置30s，反復凍融67次；（3）將上述離心管在室溫下靜置5 min，再使用高速冷凍離心機4 ℃ 12000 rpm離心10 min；（4）將上述所得上清液小心吸取轉入另一新離心管中， ml氯仿，反復振蕩搖勻，室溫下靜置10 min；（5）將上述離心管放入高速冷凍離心機中，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min；（6）用移液槍小心吸取上層水相置于新的離心管中， ml異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10 min；（7）上述離心管置于高速冷凍離心機4 ℃ 12 000 rpm離心10 min后棄上清，沉淀用1 ml DEPC水處理過的75%無水乙醇漂洗兩次。（8）上述離心管7500轉，離心5min后棄上清，將沉淀的RNA在室溫下自然干燥，使得乙醇完全蒸發(fā)；（9）最后加入22 181。l無RNAase的純水重懸干燥后的RNA，于80℃?zhèn)溆茫?馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA的提取馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA的提取采用DNA提取試劑盒（QIAGEN）進行，操作方法依照說明書進行，具體步驟如下：（1）收集皿蓋上新鮮的馬鈴薯腐爛莖線蟲，滅菌水洗滌3次，液氮中充分研磨成粉末后轉入到2 ml tube離心管中；（2）加入180 181。l Buffer GL、10 181。l RNase A（10 mg/ml）和20 181。l 蛋白酶K至離心管中，56 ℃水浴23 h，期間顛倒混勻數(shù)次，確保蟲體充分裂解；（3）上述裂解液中加入200 181。l Buffer GB，充分吸打混勻；（4）將上述溶液移至Spin Column中，于12000 rpm離心2分鐘后棄濾液；（5）所得沉淀中加入500 181。l Buffer WA，再12000 rpm離心1分鐘，棄濾液；（6）再加入500 181。l Buffer WB（Buffer WB中已加入指定體積的無水乙醇），12000 rpm離心1分鐘，棄濾液； （7）重負操作6（8）將上述Spin Column置于Collection Tube上，12000 rpm離心2分鐘；（9）將離心后的Spin ml離心管上，加入50100 181。l的Elution Buffer，室溫下靜置5分鐘；（10）將離心管12000 rpm離心2分鐘用以洗脫DNA，重復洗脫一次可增大DNA產量。 馬鈴薯腐爛莖線蟲第一鏈cDNA的合成 第一鏈cDNA的合成采用RNA PCR Kit（AMV），合成cDNA第一鏈。PCR反應體系和條件如下： PCR反應體系： MgCl2 2 181。l 10 RT Buffer 1 181。ldNTP Mixture 1 181。lRNase Inhibitor 181。lReverse transcriptase MMLV 0. 5 181。lOligo dTAdaptor Primer 181。lTotal RNA (500 μg/181。l) 1 181。lRNase free ddH2O 181。l總體積 10 181。lPCR反應條件：1 Cycle 4260 ℃ 30 min 95 ℃ 5 min 5 ℃ 5 min20 ℃保存?zhèn)溆?3′第一鏈cDNA的合成采用3′Full RACE Core Set ′ 端cDNA第一鏈的合成。反應體系如下： 3’RACE Adaptor（5 181。mol/L） 1 181。l 5 MMLV Buffer 2 181。ldNTP Mix（10 mmol/L） 1 181。lRNase Inhibitor(40 U/181。l) 181。lReverse Transcriptase MMLV (200U/181。l) 181。lTotal RNA (1 μg/181。l) 1 181。lRNase Free dH2O 181。l總體積 10 181。l將上述反應混合物于42 ℃反應60 min以完成cDNA第一鏈的合成。70 ℃ 15 min去除反轉錄酶活性。20 ℃保存?zhèn)溆谩? 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A基因cDNA全長和基因組全長的克隆 DdHsp70A基因核心片段的擴增根據(jù)NCBI上公布的Hsp70基因氨基酸序列，對比找出保守序列，并設計簡并引物：HSP70AF：5′GCNGCNAARAAYCARGTNGCNATG3′HSP70AR：5′AARTGRTTNACCATNCKRTTRTC3′，PCR體系和條件如下：PCR反應體系：10 PCR EX Buffer 5 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。lHSP70AF（10 181。M） 3 181。lHSP70AR（10 181。M） 3 181。lcDNA模版 2 181。lEx Taq酶（5 U?181。l1） 181。l雙蒸水 181。l總體積 50 181。lPCR反應條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s59 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 1 min72 ℃ 10 min%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠（EB）染色，膠在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并照相，將目的條帶用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，連接到pMD174。18T載體中，隨后轉化到DH5α大腸桿菌細胞中。瓊脂糖凝膠DNA回收步驟如下：（1）柱平衡步驟：加入500 181。l平衡液BL至吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm離心1 min，棄廢液后將吸附柱重新放回收集管中；（2）將目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入一個干凈的離心管中，稱取凈重量；（3）往離心管中加入3倍體積的溶膠液PN（如瓊脂糖凝膠凈重為1 g，其體積可視為1000 181。l，依此類推），50 ℃水浴10 min，其間不斷溫和的翻轉離心管，以確保凝膠溶解充分。若還有未溶解的膠塊，則可再補加適量溶膠液或繼續(xù)水浴幾分鐘，直至膠塊完全溶解；（4）將上述所得膠溶液吸取到吸附柱CAZ中（吸附柱放入收集管中），室溫條件下放置2 min，再12000 rpm離心3060 s后棄除收集管中的廢液，將吸附柱CA2重新放回收集管中；（5）加入600 181。l漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無水乙醇）到上述吸附柱CA2中，12000 rpm離心3060 s后棄除收集管中的廢液，然后將吸附柱CA2重新放回收集管中；（6）向吸附柱CA2中加入漂洗液PW 600 181。l，12000 rpm離心3060 s后棄除收集管中的廢液；（7）將上述吸附柱CA2放回收集管中，再12000 rpm離心2 min，以便除盡漂洗液。將吸附柱CA2室溫條件下放置數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響后面的試驗；（8）將吸附柱CA2放入干凈的離心管中，懸空滴加60 181。l洗脫緩沖液EB于吸附膜中間位置，室溫放置2 min后12000 rpm離心2 min，收集DNA溶液；（9）可將離心得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復步驟8，以提高DNA的回收量。連接反應體系：18T Vector 1 181。l回收DNA 4 181。lSolution I 5 181。l總體積 10 181。l連接反應混合液在16 ℃下連接過夜。轉化步驟：（1） 將上述連接反應產物加入到100 181。l解凍后的DH5α感受態(tài)細胞中，冰浴30 min；（2） 42 ℃水浴熱激45 s（勿動）；（3） 立即取出冰浴12 min；（4） 往每管加入不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基890 181。l；（5） 上述溶液于37 ℃，200 rmp震蕩培養(yǎng)1 h，使細菌恢復活性；（6） 取200 181。l菌液均勻涂布在LB平板上（含氨芐青霉素100 μg/ml，IPTG 100 μg/ml，Xgal 200 μg/ml），37 ℃倒置培養(yǎng)1216 h；（7） 小心挑取白色菌落至10 ml 的LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg/ml）中擴大培養(yǎng)，37 ℃，200 rmp震蕩培養(yǎng)1216 h。對擴大培養(yǎng)的菌液采用通用引物進行PCR檢測：M13F（47）：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3′M13R（48）：5′AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3′PCR反應體系：10 PCR EX Buffer 5 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。lM13F（47）（10 181。M） 3 181。lM13R（48）（10 181。M） 3 181。l菌液 2 181。lEx Taq酶（5 U?181。l1） 181。l雙蒸水 181。l總體積 50 181。lPCR反應條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s55 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 30 s72 ℃ 10 min通過菌液PCR驗證為陽性后，送上海生工生物工程技術有限公司測序。 DdHsp70A基因3′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A基因核心片段序列，利用Primer Premier ′ RACE 引物：701GSP1：5′CGATGCGAAGCATTTGATTG3′701GSP2：5′GCGAATCATAAACGAGCCTACTGC3′′端cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。PCR反應體系和反應條件參照GeneRacerTM RACE Kit說明書進行。PCR反應體系和條件如下：（1）Outer PCR反應PCR反應體系：1 cDN