【正文】
。 DDHSP70F：（AFL69920）。 DDHSP70C:（AFL69919）。黑色區(qū)域：線蟲高度保守的氨基酸；DDHSP70A：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AHF71091）；CEHSP1：秀麗小桿線蟲（NP_503068）；DDHSP70C：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AFL69919）；CEHSP3：秀麗小桿線蟲（NP_509019）；DDHSP70F：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AFL69920）；CEHSP6：秀麗小桿線蟲（NP_504291）Underlineed：Three conserved motifs of the HSP70 family（IDLGTTS、DLGGGTFDSL、LVGGRPK）；Box：The cytoplasmic HSP70 carboxyl terminal region（EEVD）、The endoplasmic reticulum HSP70 carboxyl terminal region（KDEL）、conserved motif of mitochondrial HSP70（GDAW）.Black blocks：Conserved amino acids across all nematode. DDHSP70A:（AHF71091）。，結(jié)果如圖4所示。、腐生線蟲Panagrellus redivivus hsp70C、豬蛔蟲Ascaris suum hsp703的氨基酸序列的同源性分別為92%、91%、86%和84%。氨基酸序列含有被作為線粒體Hsp70標志的一個保守基序GDAW（123126殘基），該基序是線粒體和變形細菌特有的，因此推斷該蛋白存在于線粒體中（圖4）。DdHsp70F推導(dǎo)的氨基酸序列包含HSP70家族3個完整的典型基序（motif）：3138（IDLGTTNS）；215228（VYDLGGGTFDISIL）；355366（VLLVGGMTRMPK）。SWISSMODEL蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該HSP70在N端形成ATP酶結(jié)構(gòu)域（40419殘基），在近C端形成底物肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域（420578殘基）以及C端結(jié)構(gòu)域（572656殘基）。在C末端含有一段基序（EEVD），這是胞質(zhì)型Hsp70所特有的，說明該蛋白存在于細胞質(zhì)中。DdHsp70A推導(dǎo)的氨基酸序列包含HSP70家族3個完整的典型基序（motif）：1017（IDLGTTYS）；199212（IFDLGGGTFDVSIL）；336347（IVLVGGSTRIPK）。采用GSDS在線軟件進行基因組結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明DdHsp70F基因組由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，符合GT/AG剪切規(guī)律。將此cDNA序列命名為DdHsp70F，GenBank登錄號：JQ422277。使用NCBI在線軟件ORF finder分析，結(jié)果表明，該序列包含1個長度為1959bp的開放閱讀框（ORF），編碼了652個氨基酸，5′端起始密碼子“ATG”前存在54bp的非編碼區(qū)（UTR），3′端終止密碼子“TAG”后存在79bp的非編碼區(qū)（UTR）。 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70F基因克隆使用簡并引物HSPFF和HSPRR（表1）進行PCR擴增，回收、測序得到長度為450bp的序列（圖3A），根據(jù)該片段序列設(shè)計3′RACE引物HSPASP1和HSPASP2，以及5′端RACE引物H70FR5（表1）進行3′RACE和5′RACE擴增，回收、測序后分別得到1856bp（圖3B）和593bp（圖3C）的序列，序列拼接最后得到核苷酸長度為2092bp。Dbp M 130002000Cbp M 1750250Ebp M 150003000Bbp M 12000Abp M 1250500圖2 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70C基因克隆及基因組結(jié)構(gòu)圖Figure 2 DdHsp70C gene cloning and genomic structure of M:D2000/D5000 DNA 標準分子量；A：核心片段擴增；B：3’RACE擴增；C：5’RACE擴增；D：cDNA全長擴增；E：基因組全長擴增；F：基因組結(jié)構(gòu)圖M：D2000/D5000 DNA marker；A：PCR products of key fragment；B：PCR productions of3’RACE；C：PCR productions of 5’RACE；D：PCR products of the full length of cDNA；E：Amplification products of genomic DNA；F：Genomic structure采用HSP70CF和HSP70CR引物（表1），以馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA為模版進行PCR擴增（圖2E），回收、測序后獲得了長度為4075bp的基因組全長序列。C末端包含11bp的poly（A）尾巴，其上游含有一段加尾信號“AATAAA”。根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計特異性引物HSP70CF和HSP70CR（表1）以驗證拼接序列的正確性，回收測序得到了一條2360bp的片段（圖2D），與拼接序列完全一致，DdHsp70C基因cDNA全長為2436bp。采用GSDS在線軟件進行基因組結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明DdHsp70A基因組由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成（圖1F），符合GT/AG剪切規(guī)律。結(jié)果表明本研究克隆的馬鈴薯腐爛莖線蟲Hsp70基因為一個完整基因，將cDNA序列命名為DdHsp70A，GenBank登錄號：KF792307。使用NCBI在線軟件ORF finder分析，結(jié)果表明，該序列包含1個長度為1938bp的開放閱讀框（ORF），編碼了645個氨基酸，5′端起始密碼子“ATG”前存在45bp的非編碼區(qū)（UTR），3′端終止密碼子“TAA”后存在98bp的非編碼區(qū)（UTR）。根據(jù)該片段序列設(shè)計3′RACE引物701GSP1和701GSP2，以及5’端RACE引物701 5R1（表1）進行3′RACE和5′RACE擴增，回收、測序后分別得到1864bp（圖1B）和457bp（圖1C）的序列，最后得到實際的核苷酸長度為2081bp。2 結(jié)果與分析 馬鈴薯腐爛莖線蟲Hsp70基因的克隆 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A基因克隆使用簡并引物HSP70AF和HSP70AR（表1）進行PCR擴增，得到一條特異性條帶（圖1A），回收、測序得到長度為564bp的序列，BLAST比對結(jié)果表明，與秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans HSP松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus、麥地那龍線蟲Dracunculus medinensis等熱激蛋白基因相似度分別為91%、91%和89%。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。 DdHsp70F基因組全長擴增根據(jù)已經(jīng)得到的馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70F基因cDNA全長序列，采用Primer Premier ：HSP70FF：5′TGCCAGTTTACCGAGTGAGC3′HSP70FR：5′TTTTGGCTCCTCCGTTGTGT3′。其中PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為59 ℃，延伸時間設(shè)為2 min。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。 DdHsp70F基因5′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70F基因核心片段序列，采用Primer Premier ′ RACE 引物：SL1：5′GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG3′H70FR5：5′TCCTTGGTAGCTTGTCTTTGAG3′。其中Outer PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為55 ℃， min；Inner PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為51 ℃， min。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。 DdHsp70C基因組全長擴增根據(jù)已經(jīng)得到的馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70C基因cDNA全長序列，采用Primer Premier ：HSP70CF：5′TCTTGGACTCGTGTTATTATTG3′HSP70CR：5′ATGTCACAACAACAAACAATAAC3′。其中PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為57 ℃，延伸時間定為2 min。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。 DdHsp70C基因5′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70C基因核心片段序列，采用Primer Premier ′ RACE 引物：SL1：5′GGTTTAATTACCCAAGTTTGAG3′H70C2R5：5′TGGGCATCATTGAAGTAAGCAG3′。其中Outer PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為60 ℃，延伸時間定為2 min；Inner PCR反應(yīng)的退火溫度設(shè)為59 ℃，延伸時間定為2 min。、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s54 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 5 min72 ℃ 10 min反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。l雙蒸水 181。lEx Taq酶（5 U?181。M） 3 181。M） 3 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s54 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 2 min72 ℃ 10 min反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。l雙蒸水 181。lEx Taq酶（5 U?181。M） 3 181。M） 3 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s52 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 1 min72 ℃ 10 min反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。l雙蒸水 181。lEx Taq酶（5 U?181。M） 3 181。M） 3 181。ldNTP Mixture（10 mM） 4 181。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s55 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 2 min72 ℃ 10 min反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR后，送上海生工測序。l雙蒸水 181。lEx Taq酶（5 U?181。lMgCl2（25 mM） 5 181。l3′ RACE Inner Primer（10 181。l701GSP2（10 181。lPCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min94 ℃ 30 s55 ℃ 30 s 35 Cycles72 ℃ 2 min72 ℃ 10 min（1）Inner PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系：dNTP Mixture（ mM） 8 181。l雙蒸水 181。lEx Taq酶（5 U?181。lMgCl2（25 mM） 3 181。l3′ RACE Outer Primer（10 181。l701GSP1（10 181。PCR反應(yīng)體系和條件如下：（1）Outer PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系：1 cDNA Dilution BufferⅡ 5 181。 DdHsp70A基因3′ RACE根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A基因核心片段序列，利用Primer Premier ′ RACE 引物：701GSP1：5′CGATGCGAAGCATTTGATTG3′701GSP2：5′GCGAATCATAAACGAGCCTACTGC3′′端cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。l總體積 50 181。l1） 181。l菌液 2 181。lM13R（48）（10 181。lM13F（47）（10 181。對擴大培養(yǎng)的菌液采用通用引物進行PCR檢測：M13F（47）：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3′M13R（48）：5′AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3′PCR反應(yīng)體系：10 PCR EX Buffer 5 181。l；（5） 上述溶液于37