【正文】 120003000Cbp M 1500250Abp M 1750500B2000bp M 11000圖1 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A基因克隆及基因組結構圖Figure 1 DdHsp70A gene cloning and genomic structure of M:D2000/D5000 DNA 標準分子量；A：核心片段擴增；B：3’RACE擴增；C：5’RACE擴增；D：cDNA全長擴增；E：基因組全長擴增；F：基因組結構圖M：D2000/D5000 DNA marker；A：PCR products of key fragment；B：PCR productions of3’RACE；C：PCR productions of 5’RACE；D：PCR products of the full length of cDNA；E：Amplification products of genomic DNA；F：Genomic structure根據(jù)拼接結果分別在5′端和3′端設計特異性引物HSP701F和HSP701R（表1）進行PCR擴增，以驗證拼接序列的正確性，%瓊脂糖凝膠上進行電泳，結果表明，在1950bp左右有一條單一明亮的條帶（圖1D），回收后測序，得到了一條1927bp的片段，與拼接序列完全一致，DdHsp70A基因cDNA全長為2081bp。使用NCBI在線軟件ORF finder分析，結果表明，該序列包含1個長度為1938bp的開放閱讀框（ORF），編碼了645個氨基酸，5′端起始密碼子“ATG”前存在45bp的非編碼區(qū)（UTR），3′端終止密碼子“TAA”后存在98bp的非編碼區(qū)（UTR）。C末端包含12bp的poly（A）尾巴，其上游含有一段加尾信號“AATAAA”。結果表明本研究克隆的馬鈴薯腐爛莖線蟲Hsp70基因為一個完整基因，將cDNA序列命名為DdHsp70A，GenBank登錄號：KF792307。采用HSP701F和HSP701R引物（表1），以馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA為模版進行PCR擴增（圖1E），回收、測序后獲得了長度為3647bp的基因組全長序列。采用GSDS在線軟件進行基因組結構分析，結果表明DdHsp70A基因組由11個外顯子和10個內含子組成（圖1F），符合GT/AG剪切規(guī)律。 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70C基因克隆使用簡并引物HSP70F和HSP70R（表1）進行PCR擴增（圖2A），回收、測序得到長度為450bp的序列，根據(jù)該片段序列設計3′RACE引物HSPBSP1和HSPBSP2，以及5′端RACE引物H70C2R5（表1）進行3′RACE和5′RACE擴增，回收、測序后分別得到2138bp（圖2B）和600bp（圖2C）的序列，序列拼接最后得到的核苷酸長度為2436bp。根據(jù)拼接結果設計特異性引物HSP70CF和HSP70CR（表1）以驗證拼接序列的正確性，回收測序得到了一條2360bp的片段（圖2D），與拼接序列完全一致，DdHsp70C基因cDNA全長為2436bp。使用NCBI在線軟件ORF finder分析，結果表明，該序列包含1個長度為2019bp的開放閱讀框（ORF），編碼了672個氨基酸，5′端起始密碼子“ATG”前存在22bp的非編碼區(qū)（UTR），3′端終止密碼子“TGA”后存在395bp的非編碼區(qū)（UTR），在5′端存在反式剪接引導序列SL1。C末端包含11bp的poly（A）尾巴，其上游含有一段加尾信號“AATAAA”。結果表明本研究克隆的馬鈴薯腐爛莖線蟲Hsp70基因為一個完整基因，將cDNA序列命名為DdHsp70C，GenBank登錄號：JQ422276。Dbp M 130002000Cbp M 1750250Ebp M 150003000Bbp M 12000Abp M 1250500圖2 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70C基因克隆及基因組結構圖Figure 2 DdHsp70C gene cloning and genomic structure of M:D2000/D5000 DNA 標準分子量；A：核心片段擴增；B：3’RACE擴增；C：5’RACE擴增；D：cDNA全長擴增；E：基因組全長擴增；F：基因組結構圖M：D2000/D5000 DNA marker；A：PCR products of key fragment；B：PCR productions of3’RACE；C：PCR productions of 5’RACE；D：PCR products of the full length of cDNA；E：Amplification products of genomic DNA；F：Genomic structure采用HSP70CF和HSP70CR引物（表1），以馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA為模版進行PCR擴增（圖2E），回收、測序后獲得了長度為4075bp的基因組全長序列。采用GSDS在線軟件進行基因組結構分析，結果表明DdHsp70C基因組由13個外顯子和12個內含子組成（圖2F），符合GT/AG剪切規(guī)律。 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70F基因克隆使用簡并引物HSPFF和HSPRR（表1）進行PCR擴增，回收、測序得到長度為450bp的序列（圖3A），根據(jù)該片段序列設計3′RACE引物HSPASP1和HSPASP2，以及5′端RACE引物H70FR5（表1）進行3′RACE和5′RACE擴增，回收、測序后分別得到1856bp（圖3B）和593bp（圖3C）的序列，序列拼接最后得到核苷酸長度為2092bp。根據(jù)拼接結果設計特異性引物HSP70FF和HSP70FR（表1）以驗證拼接序列的正確性，結果得到了一條1986bp的片段（圖3D），與拼接序列完全一致，DdHsp70F基因cDNA全長為2092bp。使用NCBI在線軟件ORF finder分析，結果表明，該序列包含1個長度為1959bp的開放閱讀框（ORF），編碼了652個氨基酸，5′端起始密碼子“ATG”前存在54bp的非編碼區(qū)（UTR），3′端終止密碼子“TAG”后存在79bp的非編碼區(qū)（UTR）。C末端包含11bp的poly（A）尾巴。將此cDNA序列命名為DdHsp70F，GenBank登錄號：JQ422277。采用HSP70FF和HSP70FR引物（表1），以馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA為模版進行PCR擴增（圖3E），回收、測序后獲得了長度為4323bp的基因組全長序列。采用GSDS在線軟件進行基因組結構分析，結果表明DdHsp70F基因組由11個外顯子和10個內含子組成，符合GT/AG剪切規(guī)律。Ebp M 130005000Abp M 1250500Bbp M 110002000Cbp M 1500750Dbp M 110002000圖5 馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70F基因克隆及基因組結構圖Figure 5 DdHsp70F gene cloning and genomic structure of M:D2000/D5000 DNA 標準分子量；A：核心片段擴增；B：3’RACE擴增；C：5’RACE擴增；D：cDNA全長擴增；E：基因組全長擴增；F：基因組結構圖M：D2000/D5000 DNA marker；A：PCR products of key fragment；B：PCR productions of3’RACE；C：PCR productions of 5’RACE；D：PCR products of the full length of cDNA；E：Amplification products of genomic DNA；F：Genomic structure 馬鈴薯腐爛莖線蟲Hsp70基因的序列分析馬鈴薯腐爛莖線蟲DdHsp70A、DdHsp70C和DdHsp70F預測蛋白分別是由64672和652個氨基酸殘基組成的多肽，預測分子量（Mw）、等電點（pI）、。DdHsp70A推導的氨基酸序列包含HSP70家族3個完整的典型基序（motif）：1017（IDLGTTYS）；199212（IFDLGGGTFDVSIL）；336347（IVLVGGSTRIPK）。SWISSMODEL蛋白三維結構預測顯示該HSP70在N端形成ATP酶結構域（7189殘基），在近C端形成底物肽結合結構域（388545殘基）以及C端結構域（540621殘基）。在C末端含有一段基序（EEVD），這是胞質型Hsp70所特有的，說明該蛋白存在于細胞質中。DdHsp70C推導的氨基酸序列包含HSP70家族3個完整的典型基序（motif）：4653（IDLGTTYS）；235248（VFDLGGGTFDVSLL）；371382（IVLVGGSTRIPK）。SWISSMODEL蛋白三維結構預測顯示該HSP70在N端形成ATP酶結構域（40419殘基），在近C端形成底物肽結合結構域（420578殘基）以及C端結構域（572656殘基）。在C末端含有一段基序（KDEL），這是內質網(wǎng)型Hsp70所特有的，說明該蛋白存在于內質網(wǎng)中。DdHsp70F推導的氨基酸序列包含HSP70家族3個完整的典型基序（motif）：3138（IDLGTTNS）；215228（VYDLGGGTFDISIL）；355366（VLLVGGMTRMPK）。SWISSMODEL蛋白三維結構預測顯示該HSP70在N端形成ATP酶結構域（28401殘基），在近C端形成底物肽結合結構域（403559殘基）以及C端結構域（553628殘基）。氨基酸序列含有被作為線粒體Hsp70標志的一個保守基序GDAW（123126殘基），該基序是線粒體和變形細菌特有的，因此推斷該蛋白存在于線粒體中（圖4）。同源性分析表明，、%，與大豆孢囊線蟲Heterodera glycines Hsp70、 HSP班氏線蟲Wuchereria bancrofti Hsp70的相似度分別為86%、85%和85%。、腐生線蟲Panagrellus redivivus hsp70C、豬蛔蟲Ascaris suum hsp703的氨基酸序列的同源性分別為92%、91%、86%和84%。DdHsp70F基因的氨基酸序列與馬來絲蟲Brugia malayi hsp70F、 hsp70蒙古裸腹溞Moina mongolica hsp70以及肩突硬蜱Ixodes scapularis hsp70的氨基酸序列的同源性分別為77%、76%、75%和75%。，結果如圖4所示。圖4 馬鈴薯腐爛莖線蟲熱激蛋白與秀麗小桿線蟲熱激蛋白的氨基酸序列比對結果Figure 4 The alignment result of heat shock protein of with HSP proteins of 橫線：三段保守的HSP70家族簽名序列（IDLGTTS、DLGGGTFDSL、LVGGRPK）；方框：胞質型HSP70 C末端標志性滯留信號基序（EEVD）、內質網(wǎng)型HSP70 C末端標志性滯留信號基序（KDEL）、線粒體型HSP70保守基序（GDAW）。黑色區(qū)域：線蟲高度保守的氨基酸；DDHSP70A：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AHF71091）；CEHSP1：秀麗小桿線蟲（NP_503068）；DDHSP70C：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AFL69919）；CEHSP3：秀麗小桿線蟲（NP_509019）；DDHSP70F：馬鈴薯腐爛莖線蟲（AFL69920）；CEHSP6：秀麗小桿線蟲（NP_504291）Underlineed：Three conserved motifs of the HSP70 family（IDLGTTS、DLGGGTFDSL、LVGGRPK）；Box：The cytoplasmic HSP70 carboxyl terminal region（EEVD）、The endoplasmic reticulum HSP70 carboxyl terminal region（KDEL）、conserved motif of mitochondrial HSP70（GDAW）.Black blocks：Conserved amino acids across all nematode. DDHSP70A:（AHF71091）。CEHSP1: （NP_503068）。 DDHSP70C:（AFL69919）。CEHSP3: （NP_509019）。 DDHSP70F：（AFL69920）。 CEHSP6: （NP_504291） 系統(tǒng)發(fā)育樹分析將NCBI登錄的部分Hsp70氨基酸序列運用MEGA5．0軟件采用最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結果表明，DDHSP70A與秀麗隱桿線蟲CEHSP班氏絲蟲WBHSP70、大豆孢囊線蟲HGHSP70、珠雞NMHSPA8聚在同一分支中，均屬于胞質型Hsp70家族；DDHSP70C與大豆孢囊線蟲HGHSPC、秀麗隱桿線蟲CEHSP金齒復活線蟲PRHSP70C、黃鱔MAHSP705聚在同一分支中，均屬于內質網(wǎng)型Hsp70家族；DDHSP70F與馬來絲蟲BMHSP70F、秀麗隱桿線蟲CEHSP肩突硬蜱ISHSP70、蒙古裸腹溞MMHSP70聚在同一分支中，均屬于線粒體型Hsp70家