【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 度可選擇用 30%PEG濃縮 ） 。 此不被吸附的即為純化的 γ球蛋白； 6. 將收集到的蛋白液合并，紫外分光光度計(jì)法 (見實(shí)驗(yàn) 1)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，取部分溶液進(jìn)行純度鑒定、分子量和等電點(diǎn)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)； 7. 用完的凝膠柱用 1M NaCl流洗干凈，再用 NH4Ac緩沖液（ ）流洗平衡后可重復(fù)使用，但應(yīng)將頂部吸去并新添，暫不用時(shí)可將其倒出，浸于 1%正丁醇的緩沖液中，以防霉變。 8. 純化白蛋白 取上一實(shí)驗(yàn)所保存溶液 （ 白蛋白 ） , 再對(duì) PBS（ ） 透析 24hr， 更換數(shù)次 PBS， 使蛋白質(zhì)溶液中 pH為 ；透析后白蛋白樣品上柱后 ， 改用 mol/L NH4Ac 緩沖液 （ ）洗滌 ， 流出約 30 ml（ 其中含 α–及 β–球蛋白 ） 后 ， 將柱上的緩沖液面降至與纖維素床表面平齊 。 然后改用 mol/L NH4Ac 緩沖液 （ ） 洗脫 ， 并用 20%磺基水楊酸檢查流出液是否含有蛋白質(zhì) 。 由于純化的白蛋白仍然結(jié)合有少量膽色素等物質(zhì) ， 故肉 眼可 見一層淺黃色的成分被 mol/L NH4Ac 緩沖液洗脫下來(lái) ， 大約改用 mol/L NH4Ac 洗脫約 4 ml時(shí) ，即可試出有蛋白質(zhì)白色混濁 ， 立即連續(xù)收集 3管 ，每管 10滴 ， 此即為純化的白蛋白液 ， 取其中蛋白質(zhì)濃度高的兩管留作含量測(cè)定和純度鑒定用 （ 視收集量和蛋白質(zhì)的濃度可選擇用 30%PEG濃縮 ） 。 用過(guò)的 DEAE–cellulose層析柱 ， 應(yīng)重新再生平衡 ， 方法如下 ， 先用 20 ml mol/L NaCl– mol/L NH4Ac流洗 ， 再用 40 ml mol/L NH4Ac（ ） 流洗平衡即可 。 暫不用時(shí)可將其倒出 ， 浸于 1%正丁醇的緩沖液中 ， 以防霉變 。 【 注意事項(xiàng) 】 1. 裝柱時(shí)柱子一定要垂直； 2. 裝柱時(shí)應(yīng)注意，柱床內(nèi)不得產(chǎn)生界面、氣泡，表面要平整； 3. 柱子用完后一定要用高濃度的鹽溶液洗凈 。 實(shí)驗(yàn)四 SDS聚丙烯酰胺（ PAGE）凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 SDSPAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理。 。 SDSPAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。 【 基本原理 】 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的分辨率，用它分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白組分的分子大小和形狀以及所帶電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。將已知相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知相對(duì)分子量的蛋白質(zhì)樣品，在相同的條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得它的相對(duì)分子量。也可以用相關(guān)分析軟件得出回歸方程并計(jì)算出結(jié)果。 【 儀器、材料與試劑 】 （一）儀器 1. 電泳儀 2．垂直平板電泳槽 3．微量進(jìn)樣器 （二）材料 1. IgG： （三）試劑 1. 凝膠貯液：丙稀酰胺（ Acr） 30g、雙丙稀酰胺（ Bis） ， ddH2O溶解，定容至 100ml。 2. TrisHCl緩沖液： gTris加入 50ml ddH2O使之溶解，再加入 3ml 1M HCl溶液，混勻后在 pH計(jì)上調(diào) pH至 ，最后加 ddH2O定容至 100ml。 3. 分離膠緩沖液： Tris 1M HCl溶液，再加 ddH2O到 100ml， 。 4. 電極緩沖液： 3 g Tris、 g甘氨酸、 1g SDS， ddH2O定容至 1000ml。 5. 樣品緩沖液： 、 基乙醇、 100mgSDS、 2mg溴酚藍(lán)、 2ml TrisHCl （ ） 緩沖液， ddH2O定容至 10ml。 6. 過(guò)硫酸銨（ AP）溶液： 1gAP溶于10ml ddH2O中（要求現(xiàn)用現(xiàn)配）。 7. 四甲基乙二銨（ TEMED）。 8. 染色液： g 考馬斯亮蘭 R250，溶于 500ml固定液中，混勻。 9. 脫染液： 75mL冰醋酸、 50mL甲醇、875ml水，混勻。 10. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白（次高分子量）。 11. 濃縮膠緩沖液： Tris 1M HCl 溶液 ，加 ddH2O到 100ml， 。 12. 固定液：取 50%甲醇 454mL，冰醋酸46ml混勻。 【 實(shí)驗(yàn)步驟 】 1. 將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，安裝好；用1%的瓊脂糖電泳緩沖液（ 1g瓊脂糖溶于 100m l電泳緩沖液）封嚴(yán)玻璃板的邊和底（保證不漏膠 /新式電泳槽此步免）； 2. 配分離膠（ （ ）＋ 溶液＋ ， 50μl10%SDS溶解，混勻后再加入 50181。l AP和 10181。l TEMED，混勻） 。 3. 將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽高三分之二處，加 1~2cm高的蒸餾水密封。待膠凝固后（約需 30min）倒掉水，用吸水紙吸干； 配濃縮膠 （ （ ） ＋ 凝膠溶液＋ 蒸餾水 ， 20μl10%SDS溶解 ， 混勻后再加入 25μl AP和 10181。l TEMED ， 混勻 ） ， 將 配 好 的 濃 縮 膠 立即倒入凝膠槽 （ 插入梳子不溢出為宜 ） ，插入梳子； 對(duì)于不同分子量樣品建議使用的凝膠濃度 分 子 量 膠 濃 度（ %） 104 20~30 14 104 15~20 4 1041 105 10~15 1 1055 105 5~10 5 105 2~5 4. 待膠凝固后，拔出梳子，加入電泳緩沖液（淹沒(méi)膠，但不高于電泳槽）； 5. 樣品處理：取標(biāo)準(zhǔn)蛋白或樣品 1020181。l，加入 1020μl樣品緩沖液，混勻， 100℃ 水浴加熱 3~5min。 6. 進(jìn)樣：將處理好的樣品 10181。l加入到凝膠孔中，連接電泳儀； 7. 電泳：打開電源，調(diào)整電壓至 100V，開始電泳，待樣品全部進(jìn)入凝膠后，將電壓調(diào)至 120V，待指示劑（溴酚蘭）到達(dá)凝膠的底部 距離下緣 1cm時(shí)停止電泳，取下玻璃板，小心地把其中一塊玻璃板從凝膠上取下來(lái)，測(cè)量分離膠的長(zhǎng)度及分離膠上沿至溴酚藍(lán)帶中心的距離，記錄于表中，或者在溴酚藍(lán)帶的中心插入一段細(xì)銅絲以標(biāo)出染料的位置，取出分離膠（注意保持膠的完整性）； 8. 固定：將膠置于固定液中浸泡 30min； 9. 染色：將分離膠浸入染色液中染色 30min； 10. 脫染：取出分離膠，先用蒸餾水漂洗一次，浸入脫染液中脫染，室溫浸泡凝膠或 37℃ 加熱使其脫色，更換幾次脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止； 11. 將膠片小心放置于一塊玻璃板上，分別測(cè)量分離膠的長(zhǎng)度、樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的泳動(dòng)距離（分離膠上沿至各蛋白區(qū)帶中線的距離）； 12. 凝膠照相； 1電泳遷移率的計(jì)算 （ 1）不插銅絲的計(jì)算方法： 遷移率 =（蛋白質(zhì)移動(dòng)距離 / 染料移動(dòng)距離） （染色前膠長(zhǎng) / 脫色后膠長(zhǎng)） （ 2）插銅絲的計(jì)算方法： 遷移率 = 蛋白質(zhì)移動(dòng)距離 / 染料移動(dòng)距離 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品遷移率做橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量作縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，即可得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（也可取蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值用一般坐標(biāo)紙作圖）。測(cè)得待測(cè)蛋白質(zhì)的遷移率后，由曲線上即可查出其分子量。 【 注意事項(xiàng) 】 1． 丙烯酰胺具有中等毒性 .常人每天允許的最大暴露量不超過(guò) ,皮膚接觸可致中毒 ,癥狀為紅斑 ,脫皮 ,眩暈 ,動(dòng)作機(jī)能失調(diào) ,四肢無(wú)力等 . 2．沒(méi)有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近，一定要催化充分 ,使之完全聚合，集中處理 ,實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專門受過(guò)訓(xùn)練的人收集到一起 ,在一個(gè)特殊標(biāo)明的容器中保存 ,并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全 ,最后送交學(xué)校危險(xiǎn)品倉(cāng)庫(kù) ,統(tǒng)一處理 . 3．待測(cè)樣品如果蛋白含量低于 1mg/mL，處理之前應(yīng)先濃縮至 1mg/mL；若高于 1mg/mL，處理之前應(yīng)先稀釋至 1mg/mL。 【 思考題 】 1. 在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,當(dāng)分離膠加完后 ,需在其上加一層水 ,為什么 ? 2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用 ? 3. 在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,分離膠與濃縮膠中均含有 TEMED和 AP,試述其作用 ? 4. 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘 ? 實(shí)驗(yàn)五 等點(diǎn)聚焦測(cè)定蛋白質(zhì) 的等電點(diǎn) 【 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】 1. 掌握凝膠等電聚焦的基本原理。 2. 學(xué)習(xí)用等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的操作和方法。 【 實(shí)驗(yàn)原理 】 蛋白質(zhì) （ 酶 ） 、 多肽等兩性電解質(zhì) ， 其所帶電荷的數(shù)量與性質(zhì) ， 隨所處環(huán)境的 pH而變化 。 環(huán)境 pH低于其等電點(diǎn)時(shí) ， 帶正電荷 ， 在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；環(huán)境 pH高于其等電點(diǎn)時(shí) ， 帶負(fù)電荷 ， 在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)；環(huán)境 pH等于其等電點(diǎn)時(shí) ， 不帶電荷 ， 在電場(chǎng)中不移動(dòng) 。 據(jù)此 ， 在電泳系統(tǒng)中創(chuàng)造一個(gè)由陽(yáng)極向陰極 ， pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定 pH梯度環(huán)境 ， 那么處在這種系統(tǒng)中具有不同等電點(diǎn)的各種蛋白質(zhì) ， 將根據(jù)所處環(huán)境的pH與其自身等電點(diǎn)的差異 ， 分別帶上正電荷或負(fù)電荷 ， 并向與它們各自的等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)?pH環(huán)境位置處移動(dòng) ， 當(dāng)?shù)竭_(dá)該位置時(shí)即停止移動(dòng)