【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 再向各管分別加入40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2毫升，搖勻，立即放入40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5分鐘后取出，以終止酶的活動(dòng)，然后準(zhǔn)備下步糖的測(cè)定。 α淀粉酶及β淀粉酶總活性的測(cè)定：取上述酶液26毫升，放入容量瓶中，用蒸餾水稀釋至100毫升（稀釋程度視酶活性大小而定）混合均勻后，取4支試管。以下步驟重復(fù)α淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同樣準(zhǔn)備糖的測(cè)定。 麥芽糖的測(cè)定：（1） 取25毫升刻度試管7個(gè)，編號(hào)，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1毫克/毫升）0、、置沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，用分光光度計(jì)在520nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2） 樣品的測(cè)定：取以上各管中酶作用后的溶液及對(duì)照管中的溶液各2毫升，分別放入25毫升具塞刻度試管中，再加入2毫升3,5二硝基水楊酸試劑，混勻，置沸水中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，混勻。用分光光度計(jì)在520nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄消光值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。五、 結(jié)果計(jì)算： A —— α淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖（在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得值）A` —— α淀粉酶的對(duì)照管中麥芽糖量B —— （α+β） 淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量B` —— （α+β） 淀粉酶的對(duì)照管中麥芽糖量C —— 比色時(shí)所用樣品液毫升數(shù)實(shí)驗(yàn)七 脂肪浸提——索氏脂肪浸提法一、 目的：學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪提取的原理和測(cè)定方法。二、 原理：用脂肪溶劑將脂肪從樣品中浸提出來，然后將溶劑蒸發(fā)除去，稱取瓶中殘留物的重量或稱量樣品損失的重量，即可求出樣品中粗脂肪的含量。在測(cè)定樣品含油量時(shí)，通常采用沸點(diǎn)低于60℃的有機(jī)溶劑作為脂肪溶劑 (如乙醚和沸點(diǎn)為30℃至60℃的石油醚)所提取的脂溶性物質(zhì)為脂類物質(zhì)的混合物，其中含有脂肪、游離脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有機(jī)酸等，因此稱為粗脂肪。三、 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑： 實(shí)驗(yàn)材料：（1）待測(cè)植物樣品；（2）濾紙筒。 儀 器：（1）蘭氏脂肪浸提儀；（2）電熱恒溫水?。唬?）分析天平。 試 劑：（1）乙醚。四、 操作步驟：儀器的安裝：將索氏脂肪浸提取儀的冷凝管及脂肪接受瓶的磨砂玻璃接口處用鉛筆編號(hào)，洗凈烘干。脂肪接受瓶放入干燥器內(nèi)冷卻后稱取空瓶質(zhì)量，仍放回干燥器內(nèi)備用。將冷凝器用鐵駕臺(tái)卡夾安裝在加熱用的電熱恒溫水浴上，裝牢。在冷凝器的進(jìn)出水口分別裝上橡膠管，通向冷凝器內(nèi)蛇型管的短管為進(jìn)水口，通向外層的短管為出水口。樣品的稱?。喝V紙筒（25ф70毫米）截成35毫米的長(zhǎng)度，用鉛筆編號(hào)，兩邊對(duì)稱的夾上一個(gè)回形針，留出一段鐵環(huán)作掛鉤用。在分析天平上稱取空濾紙筒的重量，加入經(jīng) 1 毫米篩孔制備的樣品2 — 3克，稱準(zhǔn)其重量，再向?yàn)V紙筒塞入脫脂棉一小塊，防止樣品散失，將已加入樣品的濾紙筒放在一個(gè)小燒杯內(nèi)，然后放入90℃的真空干燥烘箱內(nèi)烘5—6 小時(shí)，取出放入干燥器內(nèi)冷卻備用。 脂肪的浸提：將濾紙筒掛在冷凝器內(nèi)固定在桿下端的鉤子上，再將脂肪瓶加入無(wú)水乙醚70毫升，套在冷凝器下面的磨口上。把裝好冷凝器的脂肪瓶放在預(yù)先調(diào)好溫度（5060℃）的電熱水浴上。松開固定桿上的止水夾，將濾紙筒浸入乙醚內(nèi)，開放冷凝水閥門，注意乙醚煮沸的情況，要求回流速度適當(dāng)，不可太快，以免冷凝不及乙醚在冷凝器上部逸失。濾紙筒內(nèi)樣品經(jīng)熱沸的乙醚浸提20分鐘后，提起濾紙筒操作桿至最高位置，冷凝后的乙醚自溢流管流入，裝滿濾紙筒，使之淋洗濾紙筒上部的筒壁，然后從乙醚逐步回收管回收乙醚，直至脂肪接受瓶中的乙醚完全蒸發(fā)干為止。關(guān)閉電源，關(guān)上冷凝水的閥門。 脂肪瓶的干燥和濾紙筒乙醚的回收：脫下脂肪瓶，用綢布擦去手摸的痕跡及沾上的塵土，放入90℃的直空干燥箱內(nèi)烘4560分鐘后取出放入干燥器內(nèi)，冷卻半個(gè)小時(shí)后稱重。濾紙筒脫離掛鉤后立即放入一個(gè)空的脂肪瓶?jī)?nèi)，一個(gè)脂肪瓶可以同時(shí)放入48個(gè)，套上冷卻器，開放冷卻水，打開水浴電源回收乙醚。五、計(jì)算結(jié)果：六、附注：乙醚易燃，操作時(shí)應(yīng)特別注意，加乙醚時(shí)不要打開電門，脂肪瓶與冷凝器的結(jié)合必須吻合，不能漏氣，脂肪浸提儀附近不能有明火閃動(dòng)。乙醚試劑瓶應(yīng)遠(yuǎn)離加熱器。實(shí)驗(yàn)八 一種簡(jiǎn)單實(shí)用的提取植物DNA的方法一、 目的與原理：植物DNA的提取是植物分子生物學(xué)和基因工程研究的一種基本的技術(shù)，至今已有了數(shù)種方法。此方法最大的特點(diǎn)是：將SDS同時(shí)用作細(xì)胞膜的去污劑和蛋白質(zhì)的變性劑，變性的蛋白質(zhì)通過離心而不是酚抽提除去，使得整個(gè)操作過程變得簡(jiǎn)單快捷，比較溫和，1小時(shí)左右就可以獲得純化的植物DNA。用這種方法得到的DNA能直接被限制性內(nèi)切酶酶解，純度較高，適用于分子生物學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)的目的是掌握DNA提取的原理和方法。二、 材料與方法： 植物材料：螺旋藻（Spirulina platensis）、水稻（Oryza sativa）和煙草（Nicotianatabacum）. 試劑和溶液：（1）20SSC：3molL1檸檬酸鈉，：（2）溶菌酶、10μgμl1Rnase、10%SDS（均為Sigma產(chǎn)品）；（3）酚：氯仿：異戊醇=25：24：1（4）TE：10mmolL1TrisHCL、1mmolL1EDTA。提取步驟：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的螺旋藻細(xì)胞，懸浮于5倍體積（v/w）含2mgmL1溶菌酶的20SSC中，室溫保持10分鐘，偶爾搖動(dòng)混勻。水稻幼苗和煙草嫩葉在液氮中研磨成粉狀后，立即用5倍體積的20SSC懸浮，并輕輕拌勻。上述懸浮液在冰上先放置3分鐘，然后加入10% SDS至終濃度為2%，混勻；繼續(xù)放置10分鐘后，在4℃用11000g離心15分鐘。上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并用相同體積的TE稀釋，再加入RNase至終濃度為10μgml1，室溫放置30分鐘。11000g離心15分鐘，所得的DNA沉淀用70%的乙醇洗兩次后，真空中抽干或自然干燥，最后溶于適量的TE中。三、 結(jié)果與討論：利用本方法，從煙草、水稻和螺旋藻中提取了DNA。因?yàn)檎麄€(gè)過程的操作步驟較少，也較溫和，減少了DNA被弄斷的機(jī)會(huì)，所以所得的DNA分子量較大，大部分都比完整的λ噬菌體的DNA（）還大。另外，用此方法所提的DNA的OD260/，并能被限制性內(nèi)切酶酶切，顯示有較好的純度。在使用本方法時(shí)，須注意下面的幾個(gè)問題。當(dāng)20SSC的懸浮液中加入SDS至2%后，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絮狀物質(zhì)，表明蛋白質(zhì)已經(jīng)變性，這是本方法的主要特點(diǎn)之一。它通過變性后離心而不是常用的多次酚抽方法，將絕大部分的蛋白質(zhì)除去。離心所得的上清液，需要用TE稀釋，這是因?yàn)槿芤褐械柠}濃度較高，如不稀釋，RNase就無(wú)法起作用；而且在沉淀DNA時(shí)，如用乙醇會(huì)將溶液中的鹽析出，如用異戊醇則形成兩相的界面，將溶液中鹽的濃度降低后，就解決了這些問題。但是，加大稀釋TE的體積，對(duì)于DNA的產(chǎn)量并無(wú)非常明顯的作用，用等體積的TE稀釋即可。DNA抽提液經(jīng)RNase酶解后，再用酚：氯仿：異戊醇抽提一次，用以除去剩余的蛋白質(zhì)和酶。本方法適用于大量和微量的DNA制備。大量制備時(shí)，RNase酶解和酚：氯仿：異戊醇的抽提步驟可以在DNA濃縮一些后再使用，這樣就較便于操作，并且節(jié)省RNase和酚。通常，用這種方法能從每克新鮮組織中提取到10至15μg的DNA。實(shí)驗(yàn)九 聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定大麥、小麥種子純度一、 目的：本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，提取分離種子中的蛋白質(zhì)，根據(jù)不同品種的蛋白質(zhì)譜帶與標(biāo)準(zhǔn)譜帶的差異，可鑒定出品種的真實(shí)性和純度。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖钦莆站郾０冯娪镜脑?、?shí)驗(yàn)方法以及此方法在種子鑒定中的應(yīng)用。二、 原理：從種子中提取的醇溶蛋白在凝膠的分子篩效應(yīng)和電泳分離的電荷效應(yīng)作用下得到良好的分離，通過顯色顯示蛋白質(zhì)譜帶類型。不同品種由于遺傳組成不同，種子內(nèi)所含的蛋白質(zhì)種類有差異，這種差異可利用電泳圖譜加以鑒別，從而對(duì)品種真實(shí)性和純度進(jìn)行鑒定。三、 儀器和試劑： 儀器：電泳儀（滿足穩(wěn)壓500V）、離心機(jī)、垂直板電泳槽、鉗子、5ml、10ml移液管、微量進(jìn)樣器、聚丙烯離心管。 試劑：尿素，乙醇，甘氨酸，甲基綠，三氯乙酸，冰乙酸，過氧化氫，硫酸亞鐵，抗壞血酸，α氯乙醇。 藥劑配制：（1） 蛋白質(zhì)提取液：小麥：，加蒸溜水至100毫升。低溫保存。大麥：，加入118克尿素，再加入1毫升β巰基乙醇，加蒸溜水至100毫升。低溫保存。（2） 電泳緩沖液：，加4毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低溫保存。（3） 凝膠緩沖液：，加20毫升冰乙酸，定容至1000毫升。低溫保存。（4） %過氧化氫：30%過氧化氫2毫升，加蒸溜水至100毫升。低溫保存。（5） 染色液：，加入50克三氯乙酸，加水至500毫升。（6） 凝膠液：丙烯酰胺20克，尿素12克，，用凝膠緩沖液溶解并定容至200毫升。低溫保存。四、 實(shí)驗(yàn)步驟： 樣品提取：一般每個(gè)樣品測(cè)定100粒種子，若更準(zhǔn)確地估測(cè)品種純度，則需更多的種子。如果分析結(jié)果要與某一純度的標(biāo)準(zhǔn)值比較，可采用順次測(cè)定法（sepuential testing）來確定，即50粒作為一組，必要時(shí)刻連續(xù)測(cè)定數(shù)組，以減少工作量。如果只鑒定真實(shí)性，可用50粒。取小麥或大麥種子，用鉗子逐粒夾碎（夾種子時(shí)最好墊上小片清潔的紙，以便于清理鉗頭和防止樣品之間的污染），加入蛋白質(zhì)提取液（，）充分搖動(dòng)混合，在室溫下提取24小時(shí)，然后在18000g條件下離心15分鐘。取其上清液用于電泳。 凝膠制備：從冰箱中取出凝膠溶液和過氧化氫液，吸取10毫升凝膠溶液，%過氧化氫，搖勻后迅速倒入封口處，稍加搖動(dòng)，使整條縫口充滿膠液，讓其在510分鐘聚合封好。吸取45毫升凝膠溶液，%過氧化氫，迅速搖勻，倒入凝膠板之間，馬上插好樣品梳，讓其在510分鐘內(nèi)聚合。 進(jìn)樣：小心抽出樣品梳，將玻璃板加在電泳槽上，用濾紙或注射器吸取樣品槽中多余的水分，然后用微量進(jìn)樣器吸取1020μl樣品加入樣品槽中。 電泳：在前后槽注入電極液，前槽接正極，后槽接負(fù)極。然后打開電源，逐漸將電壓增到500V電泳時(shí)，要求在1520℃溫度下進(jìn)行。電泳時(shí)間一般為6080分鐘，具體時(shí)間可按甲基綠遷移時(shí)間來推算。 染色：將膠板小心的取下，在染色液中染色12天。一般情況不需要脫色，但為使譜帶清晰，可用清水沖洗。五、 鑒定：譜帶命名可采用相對(duì)遷移率法，或電泳程式法。根據(jù)醇溶蛋白譜帶的組成和帶型的一致性，并與標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳圖譜比較，堅(jiān)定種子真實(shí)性以及測(cè)定品種純度。實(shí)驗(yàn)十 淀粉酶的誘導(dǎo)、提取和活性測(cè)定（綜合性實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)原理大麥（或小麥）種子萌發(fā)時(shí)，種胚產(chǎn)生GA3擴(kuò)散到胚乳的糊粉層細(xì)胞（被稱為GA3反應(yīng)的“靶細(xì)胞”），刺激其合成或激活α淀粉酶，然后進(jìn)入胚乳，使貯藏的淀粉被水解為還原酶，因此，無(wú)胚種子不能釋放GA3，也不能形成與激活α淀粉酶。外加的GA3也可代替胚的釋放作用，從而誘導(dǎo)α淀粉酶的合成。在一定范圍內(nèi)，由去胚的吸脹大麥產(chǎn)生的還原糖量，與外加GA3濃度的對(duì)數(shù)成正比，由此可說明GA3對(duì)α淀粉酶的誘導(dǎo)形成。二、材料與用品材料：大麥（或小麥）種子；儀器：721分光光度計(jì)；超凈工作臺(tái)（或滅菌箱）；溫箱；搖床；恒溫水?。桓邏簻缇?；棉塞；牛皮紙；刀片；鑷子；燒杯；培養(yǎng)皿；試管；移液管；玻璃棒。藥品：103mol/L乙酸緩沖液（pH ）[每ml含鏈霉素硫酸鹽1mg（或氯霉素40μg）]、10 mg/L GA310 mg，加少量95%乙醇溶解，用蒸餾水定容至1000ml、淀粉溶液（ ml蒸餾水中不斷攪拌下加到70ml沸水中，最后加水定容至100ml）、I2 KI溶液（稱取I2 ，）、5%漂白粉溶液（W/V）、5% H2SO4溶液（W/V）、滅菌水、石英砂。三、方法與步驟材料準(zhǔn)備選擇對(duì)GA3敏感、萌發(fā)高、大小一致的小麥種子，用50% H2SO4浸泡2h，取出后，用自來水沖洗約20次，然后用力揉搓除去穎殼；用刀片將種子橫切近于等長(zhǎng)的兩半，使成無(wú)胚的半粒和有胚的半粒，各150粒分裝與兩個(gè)小燒杯內(nèi)，用5%漂白粉溶液消毒15min，在無(wú)菌條件下倒掉漂白粉溶液，用無(wú)菌水洗5次。然后將無(wú)胚與有胚的半粒種子放于內(nèi)裝一層石英沙的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入剛好浸沒種子的無(wú)菌水，將培養(yǎng)皿置于25度溫箱中吸漲2448 h。GA3系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置取干潔試管5支（編號(hào)），各加蒸餾水9ml，向1號(hào)管加GA3母液1 ml，混勻后吸出1 ml加到2號(hào)管內(nèi)；2號(hào)管混勻后吸出1 ml加到3號(hào)管內(nèi)；依次稀釋， mg/L、102 mg/L、103 mg/L、104 mg/L、105 mg/L的 GA3系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。再取干潔試管8支（07號(hào)），按表加入各種試液也材料（燒杯中吸脹的半粒大麥種子），與25度下振蕩保溫24 h，過濾（或離心），濾液（或上清液）備用。α淀粉酶活性測(cè)定取干潔試管8支（07號(hào)）， ml和淀粉溶液1 ml，再按號(hào)加入半粒種子保溫濾液（或上清液） ml混勻，于25度恒溫水浴中準(zhǔn)確計(jì)時(shí)保溫10 min（適宜的時(shí)間由預(yù)備試驗(yàn)確定，即以1mg/L GA3的反應(yīng)液與碘試劑反應(yīng)，），立即取出試管放入冷水中，加入I2 KI試劑1ml終止反應(yīng)，再加蒸餾水2ml，混勻后于620nm下測(cè)定OD值（表26），以光密度表示淀粉酶的相對(duì)活性（以蒸餾水為空白校正儀器）。以GA3濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。GA3對(duì)α淀粉酶活性的影響管號(hào)GA3溶液H2O（ml）乙酸緩沖溶液/（103mol/L）半粒種（5粒）OD值(620nm)濃度/（mg/L)體積/ml10011有胚20011無(wú)胚3101無(wú)胚4101無(wú)胚5101無(wú)