【文章內(nèi)容簡介】 一章），每年一次。每季度期間核查一次。 加樣器的校準每年至少一次。、測序儀和離心機可委托公司校準，每年一次。、水浴箱用校準合格的溫度計測量溫度，并做好記錄。 PCR儀是整個HIV1耐藥檢測最關(guān)鍵的儀器，性能的好壞決定實驗結(jié)果的準確性。因此PCR的安裝與維護應至少滿足如下要求(1) 應放置水平臺上，電源電壓須與儀器要求電壓相一致，并連接地線。(2)應在室溫15℃至25℃之間運行。(3) 每次實驗時，最好在擴增儀內(nèi)的孔中，全部放置樣品管。若樣品管少時，可用空管代替，以保證實驗的一致性和重復性。(4) 每次實驗結(jié)束后，應及時擦干孔內(nèi)存在的水分，蓋上機蓋。應定期清潔熱蓋和反應孔。(5) 應定期用電子測溫儀校準溫度，每年應進行一次熱電監(jiān)測溫度實驗。，產(chǎn)品應有名稱、批號、生產(chǎn)廠家、試劑保存條件、有效期等。，要記錄拆封時間，所有試劑嚴格控制在有效期內(nèi)使用。：要求使用無DNA和RNA酶的水。（SOP），不得擅自修改。,每次實驗按照試劑盒說明書的要求使用試劑盒提供的質(zhì)控品。(包括逆轉(zhuǎn)錄和擴增)質(zhì)控時，除待測樣品外，還應設立陽性、陰性與空白對照。陽性對照：與待測樣品同質(zhì)、HIV陽性且含有目的基因片段的標本。陰性對照：與待測樣品同質(zhì)、HIV陰性且不含有目的基因片段的標本?？瞻讓φ眨翰缓０宓臄U增試劑。陰陽對照應與樣本核酸同時提取、擴增、檢測與分析。 PCR產(chǎn)物的檢查與質(zhì)控：每次用于測序的PCR產(chǎn)物都應該電泳檢測是否擴增成功；擴增結(jié)果陰性的不應進行序列測定，每次測序50份樣本應該加入一份已知序列的樣本作為測序質(zhì)控。，一人完成的序列編輯拼接和對變異位點的判讀須由第二人復核，通過雙人判讀一致的結(jié)果才可以提交數(shù)據(jù)庫。 對5%至10%的單次提交序列按序列編輯的流程進行抽查，檢查序列的修改是否正確,是否存在不正常的移碼，如果發(fā)現(xiàn)存在移碼序列，將序列挑出來，對照圖文進行核對。檢查是否存在氨基酸的缺失，插入和終止子。 軟件對用ChromasPro所得到的序列排列和比對，再用MEGA軟件對所得到一組序列進行分子進化樹分析（參見附件1），通過對實驗室以前的數(shù)據(jù)與當前數(shù)據(jù)進行比較，分析是否存在潛在的實驗室污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染應采取相應的措施。 檢測人填寫HIV1耐藥基因型檢測結(jié)果（附表4），復核人對檢測結(jié)果進行仔細復核并對結(jié)果提出結(jié)論、簽字。、分析、總結(jié)、簽字。第七章HIV1基因型耐藥檢測能力驗證（PT）HIV1基因型耐藥檢測實驗室可以通過參加外部質(zhì)量評價，及時發(fā)現(xiàn)問題，改進實驗室工作，提高檢測質(zhì)量。確保所有進行HIV1基因型耐藥檢測的結(jié)果都有高度的一致性。HIV1基因型耐藥檢測能力驗證的組織者有國內(nèi)和國外相關(guān)機構(gòu)，國內(nèi)的能力驗證組織者必需定期參加并通過國際PT考核。7．1國內(nèi)組織的HIV1基因型檢測能力驗證（PT） 參加者：我國開展HIV1基因型耐藥檢測工作的所有實驗室，鼓勵有條件的實驗室參加國際組織的PT活動。 組織者：中國疾病預防控制中心性艾中心參比實驗室 HIV耐藥檢測能力驗證活動的實施PT樣品組成：由5份血漿樣品組成，樣品中含有耐藥毒株或藥物敏感株，耐藥毒株中有蛋白酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶基因編碼區(qū)的耐藥突變位點。 PT頻率：一年2次，分別為5月和10月。 PT樣品的接收與保存：要求參加PT的實驗室收到考核樣品后，立即進行核對、檢查，填寫HIV1基因型耐藥檢測能力驗證樣品接收專用單（附表7），如發(fā)現(xiàn)考核樣品缺失、量不足、空管等情況，及時書面或Email報告，中國疾病預防控制中心性艾中心參比實驗室負責補寄。收到樣品后應及時檢測或在70℃以下保存。 PT樣品的檢測：要求將考核樣品同實驗室常規(guī)樣品同時檢測與分析，不應作為特殊樣品處理。：參加PT的實驗室必須在規(guī)定的時間內(nèi)按要求回報。 PT結(jié)果報告內(nèi)容與格式如下：、試劑種類、擴增及結(jié)果分析按要求填入附表8。 統(tǒng)計評分參比室按照統(tǒng)一標準對各實驗室的數(shù)據(jù)進行擴增能力、基因序列編輯能力和耐藥位點判讀能力分析，采用扣分制，將蛋白酶區(qū)和反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)分別通過以下三個步驟進行統(tǒng)計評分：步驟一：堿基誤判總數(shù)（包括不完全錯誤、完全錯誤和缺失的堿基數(shù)），采用Possion分布計算P值，如果P≤,扣除2分；≤P≤,扣除1分。如果P＞，則不扣分。步驟二：完全錯誤數(shù)，如果P≤,扣除1分；如果P＞，則不扣分。步驟三：耐藥位點錯誤數(shù)，如果錯誤數(shù)≥2，扣除１分；如果錯誤≤１，則不扣分。每個樣品的蛋白酶區(qū)和反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)最多可分別扣４分，一個樣品最多可被扣8分，一個考核盤最多可扣40分。根據(jù)分值對本次質(zhì)評進行評價：被扣0—5分為優(yōu)秀，被扣6－9分為優(yōu)良，被扣1014分為合格，被扣15以上則為不合格，表示此次操作存在較大問題，或多個序列中存在小問題?！昂细瘛奔耙陨蠈嶒炇揖邆湓贖IV耐藥監(jiān)測與檢測工作中獨立承擔本省（自治區(qū)、直轄市）耐藥檢測能力，“不合格”的實驗室需要及時幫助找出原因，進行相關(guān)培訓和技術(shù)指導，并繼續(xù)追加考核樣進行考核，直到“合格”為止。 國際組織的HIV1基因型檢測能力驗證（PT）目前，國際上較有影響力的HIV耐藥檢測的PT組織機構(gòu)有三家：隸屬于美國國立衛(wèi)生研究院（national institutes of health，NIH）的病毒學檢測質(zhì)量評價（virology quality assessment，VQA）實驗室，澳大利亞國家血清學參比實驗室（national serology reference laboratory， NRL），歐盟分子診斷質(zhì)量監(jiān)控協(xié)會（quality control for molecular diagnostic，QCMD）。這三家PT組織機構(gòu)在考評方法的程序上大體相同，但是在參加質(zhì)評的實驗室范圍和質(zhì)評的側(cè)重點上存在差異，各組織機構(gòu)的考評程序及評價方法參見附件2。第八章常見問題分析及解決方案HIV1基因型耐藥檢測由于實驗操作過程復雜，影響檢測結(jié)果因素多，在實際過程中會遇到很多問題，最常出現(xiàn)的是實驗結(jié)果假陽性和假陰性問題，假陽性結(jié)果多為實驗室污染所致，包括樣品之間的交叉污染、產(chǎn)物污染或其它來源的污染；假陰性結(jié)果多由操作不當、試劑質(zhì)量差或過期及儀器不準確等因素引起。：：收集標本的容器被污染，由于標本密封不嚴溢于容器外，加樣器污染，標本的氣溶膠擴散等。 PCR試劑的污染：配制試劑時，加樣器、DEPC水、引物、酶等反應組分被模板污染。 PCR擴增產(chǎn)物污染：PCR擴增產(chǎn)物是最主要最常見的污染，因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽性。劇烈地搖動反應管、開蓋以及反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。根據(jù)以上污染來源，采取以下相應防治措施： 制訂“實驗室污染監(jiān)測及污染消除標準操作規(guī)程”，嚴格按照操作規(guī)程定期對實驗室進行污染監(jiān)測，做好記錄。（見第二章）。、分裝和儲存。 PCR用的去離子水和緩沖液均應高壓滅菌。，可在反應中以脫氧尿苷三磷酸（dUTP）代替脫氧胸苷三磷酸(dTTP)，使得產(chǎn)生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），可破壞來自以前的擴增產(chǎn)物。:實驗室人員應該經(jīng)過PCR專門培訓，能熟練準確操作PCR。實驗手法要規(guī)范，開蓋時要小心避免液體濺出，最好在開蓋之前離心幾秒鐘將壁上和蓋上的液體甩到管底。一旦發(fā)生飛濺應立即換手套。：實驗前用75%乙醇涂布于操作臺或器具表面，兩分鐘后用紙巾擦凈。生物安全柜使用前應先開啟紫外燈照射30分鐘。實驗完畢后應封好污染材料并移放入污物袋中；將75%乙醇涂布于操作臺或器具表面，兩分鐘后用紙巾擦凈；打開紫外燈照射至少15分鐘。：樣品質(zhì)量是影響核酸提取效果的重要因素之一，為了得到高質(zhì)量的核酸，在樣品采集、處理、運輸及保存過程中應嚴格按標準的操作程序進行。：提取RNA試劑效率不高或在提取過程中模板丟失過多會造成反應體系中模板量過低，模板中含有蛋白質(zhì)、雜質(zhì)或Taq酶抑制劑及模板量過高時都會導致擴增效率降低，應在提取核酸過程中選用好的提取試劑盒，除去相關(guān)雜質(zhì)，同時應根據(jù)病毒載量高低在核酸提取中加入合適的洗脫液，一般標準：病毒載量15000拷貝/ml,加100μl；病毒載量2000 15000拷貝/ml,加50μl；未知病毒載量加50μl。，引物與模板匹配性不好可能造成假陰性結(jié)果。因此，應根據(jù)樣品感染途徑及患者所在地區(qū)的主要流行株，初步判斷感染毒株的可能基因亞型，然后設計和選取合適的引物進行擴增。、兩條上下游引物的濃度是否匹配，是PCR失敗或擴增結(jié)果不理想的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，造成配制后的兩條引物濃度不匹配，導致低效率的不對稱擴增，對策為應選定一個產(chǎn)品質(zhì)量好的引物合成公司；用引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且上下游兩條引物帶的亮度應大體一致。如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，在稀釋引物時要平衡其濃度；引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或放置時間過久導致引物變質(zhì)降解失效。首先要了解試劑是否超過有效期，試劑存放方法是否達到要求，如果試劑盒在有效期內(nèi)，貯存方法正確，那么就應該仔細、慎重地判斷試劑是否是無效試劑或不合格試劑。可以用已知陽性樣品，或試劑盒提供的陽性對照，嚴格按說明書操作擴增一次，如果結(jié)果是陰性說明試劑無效或不合格。對于新購買或放置時間過久的試劑在進行樣本檢測前應先使用陽性樣本進行試驗，檢驗其擴增有效性。：酶的活性下降或喪失可導致假陰性。同時，應注意避免在反應液中漏加Taq酶或在凝膠中漏加染色劑而出現(xiàn)假陰性的情況。+濃度：Mg2+濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度高可能降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗。：通常進行PCR擴增采用的體積為20μl、50μl或100μl。PCR擴增體積是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定的，小體系（20μL）擴增后在換成大體系（50μL）擴增一定要摸索反應條件，否則容易擴增失敗。 物理原因 變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低、變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板結(jié)合而降低PCR擴增效率。：PCR擴增往往對儀器加熱溫度及各管間的差異有很高的精度要求，如果誤差太大，勢必出現(xiàn)假陰性。判斷儀器是否正常，要測定加熱體的溫度是否準確，波動范圍及各孔之間差異是否符合要求。PCR產(chǎn)物有非特異性條帶；待測樣品序列中存在特殊結(jié)構(gòu)：如G/C富集、G/C 聚集一般會造成測序信號突然減弱或消失；A、T連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測序結(jié)果會出現(xiàn)套峰；測序引物與模板匹配性不好、引物降解或引物不純時，測序反應的背景將明顯增大，直接影響到測序結(jié)果；過長引物：一般要求測序引物不大于24b